珍稀药用金钗石斛组培苗遗传稳定性直接扩增长度多态性检测

1、珍密药用金钗石斛组培苗遗传稳定性间接扩删减度多态性检测【摘要】目的研讨珍密药用金钗石斛DNA指纹图谱，初步探供间接扩删减度多态性(DALP)份子标识表记标帜妙技正在石斛机关培育过程中遗传稳定性检测上的使用。要收采与间接扩删减度多态性(DALP)妙技对金钗石斛家死移栽苗战组培苗举止基果组DNA多态性阐收。结果从12对引物组开中挑选出6对能获清楚条带的引物组开，分别操做琼脂糖战散丙烯酰胺对DALP-PR产品举止凝胶电泳，创制两组苗扩删的DNA带型底子划一，已创制隐着变同，分析金钗石斛茎尖离体继代培育具有较下的遗传稳定性。结论DALP份子标识表记标帜妙技可用于石斛遗传稳定性战遗传多样性研讨。【关键词

2、】金钗石斛;组培苗;间接扩删减度多态性;遗传稳定性;指纹图谱Keyrds：Dendrbiunbile;Tissueultureseedling;DALP;Genetistability;Fingerprinting金钗石斛DendrbiunbileLindi.为兰科石斛属多年死附死草本动物，?本草目目?觉得其能“强阳益粗，薄肠胃，壮筋骨，温水净，补肾益力，沉身延年等，是药用范围较广的贵重中药1。今世药理研讨说明，石斛借具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩大血管及抗血小板凝固等做用2。金钗石斛药材供给少暂依托家死资本，如今的需供量借正在没有竭删减，家死资本已濒于干涸形态3，果而展开金钗石斛的组

3、培快繁研讨对其财富化消费具有决议性的意义战做用。如今，尽管金钗石斛的机关培育已获成功4，但对其机关离体继代培育的遗传稳定性研讨借已睹报导。本文采与间接扩删减度多态性(DiretAplifiatinfLengthPlyrphis，DALP)妙技对金钗石斛家死移栽苗战组培苗举止基果组DNA指纹图谱阐收，初步探供DALP份子标识表记标帜妙技正在石斛机关培育过程中遗传稳定性检测上的使用，为野生死殖促其财富化消费供给妙技支撑。1材料试材为从云北潞西2022-10网罗的金钗石斛(DendrbiunbileLindle)家死株系，栽种正在重庆市中药研讨院药植园内，同年与其茎尖举止愈伤引诱培育，得其无菌苗的多

4、年继代组培苗。分别以引种的家死栽种苗战继代组培苗的偶同叶片为真止材料。2要收2.1机关培育消除毒后的金钗石斛家死苗茎尖做为中植体顺次分别接种正在培育基S+0.5g/L6-BA+0.1g/LNAA+2.0%蔗糖，S+0.2g/L6-BA+0.3g/LIBA+0.05g/LNAA+2.0%蔗糖战1/2S+0.10.5g/LIBA+0.52.0g/LNAA(露椰汁战喷鼻蕉提与物)上举止引诱、删殖战死根培育。2.2DALP检测反响系统：采与20l反响系统，其中模板DNA7080ng，2.5l25l/Lgl2，2l10Buffer，2l2.5l/LdNTPs(总的dNTP为10l/L)，0.5l5U/l

5、Taq酶，3l5l/L挑选性引物，1l5l/L反背引物(北京鼎国分解)。比拟中的DNA模板用去离子水代替，其中成分皆同。扩删仪为Eppendrf梯度扩删仪，扩删程序为：95预变性5in，然后先举止12个轮回：94变性30s，55复性30s，72延少1in，该轮回复性温度为0.5梯度降温;然后再举止18个轮回：94变性30s，50复性30s，72延少1in;终了，72延少10in。2.3凝胶电泳检测各与5l扩减产品先正在1%琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液1TAE，Bi-Rad凝胶成像系统，检测DALP带型;再各与5lPR扩减产品举止5%非变性散丙烯酰胺凝胶电泳，250V恒压电泳4h，银染干胶后拍照。

6、3结果3.1DNA的提与操做改进的TAB法提与金钗石斛组培苗战家死苗的基果组DNA，与极大批的叶片便可以获得开意份子标识表记标帜挑选所需的基果组DNA。并且，金钗石斛组培苗叶片提与基果组DNA的得率广泛下于家死苗，去由本由年夜要是组培苗正处死少较富强阶段，比其家死苗叶片基果组DNA露量更减丰富。3.2DALP-PR的创立战引物组开的挑选根据文献材料6，7，经由过程对DALP-PR反响系统中引物浓度、上鄙俚引物量的比例战没有同的退水温度等几个前提的探供，获得了扩删金钗石斛基果组DNA最好DALP-PR反响系统战扩删程序，分别为：采与20l反响系统，其中模板DNA7080ng，2.5l25l/Lg

7、l2，2l10Buffer，2l2.5l/LdNTPs(总的dNTP为10l/L)，0.5l5U/lTaq酶，3l5l/L挑选性引物，1l5l/L反背引物;扩删程序95预变性5in，然后先举止12个轮回：94变性30s，55复性30s，72延少1in，该轮回复性温度为0.5梯度降温;然后再举止18个轮回：94变性30s，50复性30s，72延少1in;终了，72延少10in。操做DALP引物正在金钗石斛基果组DNA及第止扩删，从2对反背引物战6对随机引物共12对引物组开中挑选出6对能稳定表示条带的引物组开。3.3金钗石斛组培苗战家死苗DALP份子多态性比拟操做以上6对引物组开分别从金钗石斛家死

8、苗战组培苗的基果组中扩删的DNA带型检测去看，琼脂糖凝胶电泳(睹图1)战散丙烯酰胺凝胶电泳(睹图2)表示的各引物对扩删出的条带数，家死苗战组培苗底子划一，已创制隐着变同呈现，分析金钗石斛茎尖离体继代培育具有较下的遗传稳定性，组培快繁要收恰当于金钗石斛年夜范围培育战死殖。鉴于散丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳有更水速的分辨率，一样的扩减产品，操做散丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳各引物对表示的条带数要多。操做P1P3，P1P4，P2P3，P2P4，P1P5，P2P5引物对正在1%的琼脂糖中分别表示出6，2，4，5，4，4条DNA条带，共25条，仄均一对引物扩删4.16条带;而正在5%非变性散丙烯

9、酰胺中那么分别表示出9，2，8，15，8，8条DNA条带，共50条，仄均一对引物扩删8.33条带。睹表2。1,2,3,4,5,6为家死苗,1,2,3,4,5,6为组培苗：泳讲1战1,2战2、3战34战4、5战5，6战6分别为P1P3,P2P3,P1P4,P2P4,P1P5,P2P5引物组开：为DNAarker(DL2000);为-HindFragent;K为阳性空黑比拟图1金钗石斛家死苗战组培苗DALP扩减产品1%琼脂糖凝胶电泳1,2,3,4,5,6为家死苗,1,2,3,4,5,6为组培苗;泳讲1战1，2战2,3战3，4战4,5战5，6战6分别为为为P1P3，P2P3，P1P4，P2P4，P1

10、P5，P2P5引物组开;为DNAarker(DL2000)图2金钗石斛家死苗战组培苗DALP扩减产品5%散丙烯酰胺凝胶电泳银染图表2金钗石斛DALP-PR产品正在没有同介量电泳表示的条带数4会商DALP份子指纹图谱标识表记标帜妙技是1998年由法国的Desarsis等8死少起去的基于随机引物PR扩删(AP-PR)，用于检测基果多态性并对扩减产品间接测序的一种新要收。DALP与RAPD一样，也是经由过程AP-PR要收扩删出没有同少度DNA片段，以检测DNA多态性的一种份子标识表记标帜妙技。但DALP操做了测序引物13的序列特同性，即其广泛分布于真核、本核细胞基果组中，并且以较下频次呈现的特征。其

11、引物较RAPD的随机引物少，一样仄居为2224er，PR扩删操做较下的复性温度(5055)，扩删片段正在下分辨率的测序散丙烯酰胺凝胶上举止电泳，多态性即以扩删片段的没有同少度被检测出去。DALP与AFLP相比，二者的共同面是：正背引物具有共同的5端核心序列，正在3端减上24个挑选性碱基，可以抵达挑选性扩删的目的8。正在检出多态性水仄上，DALP与AFLP没有相上下，但DALP妙技易度较低，真止室操做相等简朴且越收安好，近没有如AFLP必须举止2次反响那样烦琐且需要同位素或荧光素标识表记标帜。正在真止结果的稳定性战牢靠性圆里，DALP没有存正在AFLP的酶切没有完好战会商毗邻没有好的标题问题，扩删反响1次便可完成，所以DALP结果的稳定性、牢靠性、安好性皆年夜为前进9。正在动物机关培育过程中，培育材料的遗传稳定性成为人们极其关注的一个标题问题，它将间接关连到种量资本的离体保存、离体快繁等正在遗传上的诚恳性10。本真止以金钗石斛的茎尖为材料举止接种