5种中草药提取物对致病性弧菌的抑菌作用研究

1、5种中草药提取物对致病性弧菌的抑菌作用研究【摘要】目的研究5种中草药对致病弧菌的抑菌活性，为水产品的平安用药提供参考。方法采用纸片法和试管法，以溶珊瑚弧菌(Vibriralliilytius)、塔氏弧菌(Vibritubiashii)、副溶血弧菌(Vibriparahaelytius)、鲨鱼弧菌(Vibriarhariae)为供试菌株，测定中草药不同极性萃取局部的抑菌圈和最小抑菌浓度。结果夹竹桃叶、芒果叶、苦楝叶和羊蹄甲叶4种中草药乙酸乙酯萃取局部对供试弧菌有很好的抑菌作用；苦楝叶和羊蹄甲叶石油醚萃取局部对副溶血弧菌有抑菌作用；芒果叶的水溶性局部对塔氏弧菌有很强的抑菌作用；枇杷叶提取物对4株弧

2、菌均无抑制作用。结论除枇杷叶外，其他4种中草药可不同程度的抑制致病弧菌的生长，其抑制致病弧菌的活性成分有待于进一步研究。【关键词】中草药；弧菌；抑菌活性；最小抑菌浓度本研究以夹竹桃Neriuindiuill、芒果angiferaindiaLinn.、苦楝eliaazedarahL.、羊蹄甲Bauhiniapurpurea和枇杷Eribtryajapnia等5种中草药为研究对象，选取对水产品危害较大的4株致病弧菌为实验菌株，旨在通过抑菌活性的挑选研究，获得平安有效的天然抑菌药物。1材料与方法供试菌种：溶珊瑚弧菌(Vibriralliilytius)、塔氏弧菌(Vibritubiashii)、副溶

3、血弧菌(Vibriparahaelytius)、鲨鱼弧菌(Vibriarhariae)由南海水产研究所提供。1.2供试药材及预处理供试药材为广东常见的5种植物的叶，供试的5种植物分别是夹竹桃Neriuindiuill、芒果angiferaindiaLinn.、苦楝eliaazedarahL.、羊蹄甲Bauhiniapurpurea、枇杷Eribtryajapnia。5种供试植物均采自广东药学院药用植物园，原植物均经药用植物教研室严寒静副教授鉴定。供试植物叶片阴干后粉碎成粗粉备用。取供试药材粗粉各20g，用60%乙醇回流提取90in后滤过，滤液减压浓缩至50L后，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯萃龋

4、将3种萃取液分别减压浓缩至1g/L以生药计，即得石油醚萃取局部、乙酸乙酯萃取局部和水溶局部。1.3病原菌的别离和菌悬液制备1将4株供试菌分别划线接种于平皿培养基中，于28培养24h后，挑选单个菌落转接于斜面培养基中，28培养24h后，用2L0.9%Nal溶液进展洗脱即制得所需菌悬液。1.4纸片法抑菌试验按无菌操作规程2，汲取4株供试菌悬液各0.1L，分别加到平板培养基上并涂布均匀。将预先灭菌烘干并浸蘸定量药液的滤纸片直径为5平贴在含菌培养基上。同时用浸有相应溶剂的滤纸片做对照。每份样品做3份，结果取平均值。28倒置培养，并于12h和24h观察抑菌效果，测定抑菌圈的直径。以环丙沙星为阳性对照。1

5、.5试管稀释法测最低抑菌浓度采用试管稀释法，以相应溶剂作对照，测定有抑菌活性的药液的最低抑菌浓度(I)。每种提取物为一组，每组取无菌试管12支，于第1管中参加1.0L浓度为2105FU(lnyfringunits)/L的菌液，在210管中每管参加1.0L浓度为1105FU/L菌液，在第1管内参加中药浓缩液1.0L，充分混匀后取1.0L放入第2管，混匀后再取1.0L放入第3管，第1管内的药物浓度为原液的1/2，第2管为第1管的1/2，其余类推，直至第10管，每种药物的第11管作菌液对照仅加菌液不加中药，第12管作药物对照仅加中药不加菌液，以能抑制细菌生长培养后培养基仍清亮的最小药物浓度为其I。转

6、贴于论文联盟.ll.2结果与分析2.1纸片法抑菌试验结果见表1。由表1数据可知，阳性对照环丙沙星对4株菌均有抑制作用，而中草药提取物只对溶珊瑚弧菌、副溶血弧菌和塔氏弧菌3株菌产生抑制作用。其中，夹竹桃叶、苦楝叶和羊蹄甲叶对副溶血弧菌和溶珊瑚弧菌有抑制作用；芒果叶对溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌有抑制作用；枇杷叶对4株供试致病菌均无抑制作用。比拟不同提取部位抑菌作用可知，乙酸乙酯提取局部的抑菌活性较明显，苦楝叶、芒果叶、夹竹桃叶和羊蹄甲叶乙酸乙酯萃取局部均产生抑菌圈；石油醚萃取局部的抑菌结果显示,苦楝叶、羊蹄甲叶石油醚提取局部能产生抑菌圈；水溶性局部只有芒果叶产生抑菌圈。分析不同供试菌敏感性发现，副溶血弧

7、菌和溶珊瑚弧菌两株供试菌对夹竹桃叶、苦楝叶和羊蹄甲叶提取物均敏感，能产生不同大小的抑菌圈；塔氏弧菌只对芒果叶的水溶性局部敏感；鲨鱼弧菌对中草药提取物那么完全不敏感。表15种植物不同萃取局部的抑菌圈略注：石油醚萃取局部简称为I,乙酸乙酯萃取局部简称II,水溶局部简称III。2.2试管稀释法测定最低抑菌浓度结果见表2。由I数据可知，芒果叶提取物对溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌的I最低，说明芒果叶提取物在质量浓度为12.5g/L以生药计时即可完全抑制两菌的生长。苦楝叶和羊蹄甲提取物对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的I均为50.0g/L以生药计，夹竹桃对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的I为25.0g/L以生药计。其他组分的I均

8、大于200g/L。表25种植物不同萃取局部的最小抑菌浓度略注：“+表示I200g/L3讨论弧菌Vibri因菌体有一个弧状弯曲而得名，广泛分布于自然界中，水环境中较多，对人、鱼、蛙及其他动物均有致病性，其中霍乱弧菌和副溶血弧菌是引起人类细菌性食物中毒的首要食源性致病菌。目前，从海水、淡水和养殖水体中别离鉴定出弧菌Vibri共有100多种，其中多数是致病菌，严重危害人类的食品平安。本研究所用供试菌鲨鱼弧菌和副溶血弧菌也是?美国临床微生物手册?记载的人类致病菌。通过研究发现，鲨鱼弧菌对5种中草药均不敏感，而其他3种致病弧菌均有敏感中草药，说明该菌具有对抗普通抑菌药物的生长机制，应对其机理展开进一步的

9、研究。本研究所选5种中草药是我国岭南地区资源丰富、广泛易得的药材。本研究结果说明，除枇杷叶外，其他4种均有抑制致病弧菌的作用。比拟文献结果发现，夹竹桃粗提物对大肠杆菌、粪肠球菌等的I为0.5g/L3，本研究结果说明夹竹桃乙酸乙酯萃取物对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的I仅为25g/L。I结果差异的产生可能与以下2个因素有关：菌种不同，敏感性不同。本研究采用的是水产养殖中的致病弧菌，而文献所用供试菌为杆菌和球菌；药材的提取方法不同，本研究采用粗提后再萃取的方法处理药材，一定程度上精制了样品，去除了干扰，而文献中药物的处理方法仅为水提处理。本研究中，芒果叶的乙酸乙酯萃取物和水溶性局部分别对溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌有较好的抑菌作用，说明萃取法可以有效地将不同活性的成分分开，比拟文献所用的水煎煮法4，萃取法的优势在于将不同极性的成分进展了粗分，为进一步研究活性成分提供了根据。实验结果说明，苦楝叶和羊蹄甲叶分别对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌具有较好抑菌作用，苦楝叶的抑菌成效与其清热燥湿的作用相符合，而羊蹄甲根的抗菌活性成分已被别离获得5。此外，本研究采用环丙沙星为阳性对照药，实验发现环丙沙星对4株弧菌有广泛且明