金黄色葡萄球菌

1、金黄色葡萄球菌1 简述金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为葡萄球菌属中的一种，广泛分布于自然界，空气、土壤、水及物品上，人和动物皮肤及与外界相通的腔道中，也经常有本菌存在。本菌可产生多种毒素及酶，这些毒性物质引起局部及全身化脓性炎症，严重时可发展成为败血症和脓毒血症，是人类化脓性感染中重要的病原菌。本菌抵抗力较强，干燥情况下能生存数月，8030min的条件下尚能存活，5%石炭酸或0.1%升汞溶液1015min才会被杀死。金黄色葡萄球菌检查按增菌、分离、纯培养、革兰染色、镜检和血浆凝固酶试验等步骤进行。本法使用于外用药品及一般滴眼剂、眼膏剂的检查。2 仪器、设备及用具（

2、见大肠埃希菌2）。3 试液、指示液3.1 0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.2无菌磷酸盐缓冲液附录3.1，3.5。3.2 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液附录3.2。3.3 革兰染色液附录2.4，2.10，2.16。3.4 无菌枸橼酸纳氯化钠溶液附录2.7。3.5 血浆的制备以无菌注射器吸取灭菌的5%枸橼酸纳的0.9%的氯化钠溶液1ml，用无菌操作采取家兔（或羊、人）血9ml，轻轻混匀数分钟。待血液不凝固时，徐徐放入灭菌离心管中，及时离心（500r/min离心5min0，分离血浆，用灭菌吸管将血浆转移至灭菌试管中，置冰箱备用。临用前必须用已知血浆凝固酶试验阳性的金黄色葡萄球菌（如金黄色葡萄球菌

3、CMCC（B）26003测试，证明血浆合格后，方可用于试验。3.6 1%酚磺酞指示液附录4.4。4 培养基4.1 营养肉汤培养基附录5.1。4.2 营养琼脂培养基附录5.2。4.3 亚碲酸盐肉汤培养基附录5.15。4.4 卵黄氯化钠琼脂培养基附录5.16。4.5 甘露醇氯化钠琼脂培养基附录5.17。5 对照用菌液取金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基中，361培养1824h，用0.9%无菌氯化钠溶液，按10倍递增稀释至1:106，加入含10100cfu的对照菌菌液（一般用量为1:1060.1ml），同时用营养琼脂平板计数。6 操作方法6.

4、1 供试品的检验量9见细菌、霉菌和酵母菌计数5.3）。6.2 供试液的制备（见细菌、霉菌和酵母菌计数7）。含抑菌成分供试品供试液的制备（见大肠埃希菌6.2）。6.3 增菌培养 取营养肉汤（或亚碲酸钠肉汤）培养基2份，每份100ml，1份加入10ml供试液，另一份加入与供试液等量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为阴性对照，置361培养1824h（必要时可延至48h）。阴性对照应无菌生长。6.4 分离培养 将上述供试品增菌培养液，以接种环沾取12环培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置361培养2472h。当供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于表1所列特征

5、，可报告为1g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌。表1 金黄色葡萄球菌在三种选择性培养基上菌落形态特征培养基菌落形态特征卵黄氯化钠琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有分解卵磷脂后产生的乳浊圈，菌落直径12mm甘露醇氯化钠琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有黄色环，菌落直径0.71mm6.5 纯培养当供试品分离平板生长菌落与表1所列菌落特征相似或疑似时，应选取23个以上菌落，分别用接种针，轻轻沾取菌落中心表面培养物，接种于营养琼脂斜面上，于361培养1824h，取营养琼脂斜面培养物作革兰染色、镜检及接种营养琼脂肉汤于361培养1824h做血浆凝固酶试验。6.6 革兰染色、

6、镜检6.6.1 革兰染色（见大肠埃希菌7.5）。6.6.2 镜检金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，无芽孢，一般不产生荚膜。排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。6.7 血浆凝固酶试验试管法：取无菌试管（10mm100mm）3支，各加入血浆和0.9%无菌氯化钠溶液（1:1）0.5ml，1支加入斜面培养物菌悬液（或被检菌的营养肉汤培养液）0.5ml，其余2支作对照管：1支加入金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003菌悬液或营养肉汤培养液0.5ml作为阳性对照；另1支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照。三管同时置361水浴或恒温培养箱，3h后开始检查，以后每隔适当时间观

7、察一次，直至24h。检查时，轻轻将试管倾斜，（动作勿大）仔细观察，阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反应；不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。7 结果判定如果革兰染色结果清晰可靠，凝固酶试验阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验呈阳性结果，供试品培养物按下列情况报告或处理：7.1 疑似菌革兰染色呈阳性球菌，血浆凝固酶试验阳性反应者，报告1g或1ml供试品检出金黄色葡萄球菌（少许菌株可能不是金黄色葡萄球菌而是葡萄球菌属的其他菌种。如：中间葡萄球菌）。7.2 革兰染色镜检不是革兰阳性球菌，或血浆凝固酶试验阴性反应，报告1

8、g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌。7.3 阴性对照有菌生长，试验结果无效。7.4 阳性对照试验呈阴性结果，应当加做验证试验，考察检品是否有抑菌活性。8 注意事项8.1 金黄色葡萄球菌在上述两种分离培养基上的典型菌落为金黄色。但由于受药物影响或非典型菌株存在，亦可呈橙黄色、柠檬色或白色。做控制菌检查，对非典型菌落也有必要进行凝固酶试验做金黄色葡萄球菌的筛查，以防漏检金黄色葡萄球菌。培养基存放时间和培养时间影响色素产生，故培养基应新鲜配制。培养时间宜48h以上。8.2 如果使用干燥培养基，应按说明书配制，注意pH值是否符合规定，必要时应校正pH后灭菌使用。8.3 血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及

9、新鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆（纤维蛋白常已析出）易导致假阴性反应。此外，观察结果时不要摇动试管，因凝固初期凝块易破坏，引起假阴性试验结果。8.4 葡萄球菌属在新版Bergey手册中共收载为28种，在微生物菌种鉴定中目前应用较多的2003年出版的第八版美国临床微生物手册共收录35个菌种，44个菌型。常见有金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌三种。可参照表2进行鉴定。其中又以金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的鉴别最为重要。表2 三种葡萄球菌的主要性状性状 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 腐生葡萄球菌菌落色素 主要为金黄色 主要为白色 主要为柠檬色大小（菌落直径） 0.81.0mm 0.51.5m

10、m 0.51.5mm溶血毒素 /极少 甘露醇 需氧 d d 厌氧 凝固酶 卵黄反应 耐热DNA酶 对新生霉素敏感性 S S R噬菌体分型 多数能分型 不能分型 不能分型A蛋白 致病性 强 弱或无 注：d不定 S敏感 R耐药8.5 目前商品化的金黄色葡萄球菌检测试剂，多家微生物相关制剂公司有售，试剂具有较好的稳定性、准确性。商品化的检测试剂应当在适当的条件下保存，在有效期内应用。（六）梭菌检查法1 简述梭菌属（Clostridium）过去称为梭状芽孢杆菌属，菌体1m5m左右的革兰阳性杆菌，能形成芽孢。芽孢多大于菌体的宽度，细菌膨胀呈梭形，故名梭状芽孢杆菌。该菌属中主要病原菌有产气荚膜梭菌（C.p

11、erfringens）破伤风梭菌（C.tetani）肉毒梭菌（C.botulinum）和艰难梭菌（C.difficile）均能产生强烈的外毒素使人和动物致病。因此，对于某些用于阴道、创伤、溃疡的药品，必须控制梭菌。梭菌检查方法主要是增菌产毒培养和镜检形态观察，分离培养及过氧化氢酶试验等步骤。2 仪器、设备及用具2.1 玻璃器皿试管（30mm200mm）等。洗涤干净，无残留抗菌物质，包扎后，灭菌备用（见细菌、霉菌和酵母菌计数2.2.2）。2.2 天平、离心机、显微镜、高压蒸汽灭菌器、恒温干燥箱（见细菌、霉菌和酵母菌计数2.2.1）。2.2.1 天平、高压蒸汽灭菌器、恒温干燥箱等应定期进行校验。2

12、.2.2 厌氧培养箱（罐）有商品供应。须经测试后选用，亦可用真空干燥器（器内径240mm，全高360mm）或标本瓶（口径150mm，高350mm，盖上需钻一小孔）或其他适宜带盖能密封的容器代用。2.3 无菌室或净化工作台（见细菌、霉菌和酵母菌计数2.1.1）。2.4 手术镊、手术剪及取样匙，应严密包扎，灭菌备用。3 试液3.1 革兰染色液（附录2.4，2.10，2.16）。3.2 厌氧指示剂（附录4.8）。3.3 3%过氧化氢溶液。3.4 75%乙醇溶液。3.5 碘酊溶液或碘伏。3.6 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（附录3.2）。3.7 苯扎溴胺（1:1000）溶液。4 培养基4.1 保

13、存菌种用庖肉培养基（附录5.29）。4.2 0.1%葡萄糖庖肉培养基（附录5.30）。4.3 含庆大霉素20mg/L的哥伦比亚琼脂培养基（附录5.34）。5 对照用菌液产气荚膜梭菌CMCC（B）64615或破伤风梭菌CMCC（B）64067或脓毒梭菌CMCC（B）64857菌种接种于庖肉培养基中，培养后，涂片、染色、镜检，具典型梭菌形态的可作为菌种保存。该菌液置58保存。试验前取该菌液适量转种至庖肉培养基中，厌氧培养7296h后，即为对照用菌液。6 操作方法6.1 不同剂型阳平的前处理6.1.1 散剂 除去包装，直接称取规定量的样品即可。6.1.2 胶囊 除去包装，连壳一起称取规定量样品。6.

14、1.3 软膏剂及栓剂 称取样品10g（软膏5g），按细菌、霉菌和酵母菌计数7.3 1规定的适宜方法乳化，乳化后加入预热至45的0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液，制成1:20供试液。量取此液各10ml于3支灭菌离心管内，以3000r/min离心30min，弃上层液，保留低部约2ml残液。6.2 厌氧培养装置的准备 除商品厌氧培养箱、罐，按说明要求准备外，实验室亦可用真空干燥器、标本瓶或其他适宜容器替代使用，可选用下列一种方法制备厌氧条件：6.2.1 冷触媒法 临用前，取试管或其他容器3支，1支称入硼氢化钠0.22g（以厌氧培养容器容积1升计），1支称取枸橼酸0.33g、碳酸氢钠0.37g，另1

15、支放入经活化的钯粒约1g，与接种后的供试品培养管（或平板）及厌氧指示剂管1支，同时置于厌氧培养容器内，随即各加水5ml于前2支容器中，迅速密封容器盖。钯粒为覆盖钯的氧化铝的球状或条状颗粒（有商品出售），用前需经160干烤2h，或在电炉上灼烧5min使其活化。由于每用1次便失去催化性，因此，再次使用时需按上法活化后方能使用。将钯粒若干置室温水中，有大量气泡者为活性良好，可直接使用。此法可作为钯粒的活性检查。6.2.2 焦性没食子酸法用前，取培养皿或其他适宜容器1支，加入焦性没食子酸10g及无水碳酸钠5g（以厌氧容器容积1升计），与接种后的供试品培养管（或平板）及厌氧指示剂管1支同时置于厌氧容器内

16、，迅速密封容器盖。6.3 增菌产毒培养 取供试液10ml（相当于供试品1g或1ml）2份，分别加至0.1%葡萄糖庖肉培养基100ml管中，其中1份置80保温10分钟后迅速冷却。（若供试品为软膏剂或栓剂，则无菌吸取乳化离心后的管底部约2ml残液含供试品1.0g）。培养基若非当日配制，应于临用前煮沸5min，迅速冷却。取1支加0.05ml新鲜的对照用菌液作为阳性对照。另取1支0.1%葡萄糖庖肉培养基加等量稀释液作为阴性对照。以上两管均置7580水浴保温10min，然后放置到厌氧培养装置内，于361培养箱中培养7296h，观察结果。阴性对照管应无菌生长。阳性对照管应为培养液混浊，倒管内有气体产生，碎

17、肉有被消化变色并有恶臭等现象。阳性对照管若无上述现象，应研究原因，改进培养基及培养条件，或重新制备供试液，消除供试品中抑菌成分的影响。6.4 革兰染色、镜检 取增菌产毒培养液涂片，作革兰染色、镜检，观察染色及菌体特征。培养后形成的芽孢，有的在菌体末端初呈“火柴头”状卵圆形，继而膨大呈球形，形如鼓槌状。有的腰包卵圆形，位于菌体中央或次极端，不膨出菌体。培养时间至72h以上时，有的菌体自溶而消失，仅见游离的芽孢囊，一般染色时呈圆圈状。革兰染色幼龄菌为阳性，老龄菌可变阴性。阳性对照应有上述典型特征的菌体形态出现。当供试品培养管均不产气、无消化碎肉及臭气等现象，染色镜检未见疑似菌者，可报告1g或1ml供试品未检出梭菌。若供试品培养管两管（或仅有一管）产气，消化碎肉并有臭气，染色镜检有卵圆形至球形的芽孢，大于菌体，着生于菌体中央、次端或顶端，需进一步分离、做过氧化氢酶试验。6.5 分离培养 取试验粗管的培养物分别划线于含庆大霉素哥伦比亚琼脂培养基表面，置厌氧装置培养4872小时，若无菌落生长，判该供试品未检出梭菌。若有菌落生长，挑取每个不同形态的菌落做过氧化氢酶实验。6.6 过氧化氢酶试验 加一滴3%过氧化氢溶液至琼脂表面的单个分散的菌落上，或加至转移在载玻片上的菌