黄芪注射液对雌激素受体的激活作用研究

1、黄芪注射液对雌激素受体的激活作用研究【关键词】黄芪注射液；,基因报告系统；,雌激素受体；,HeLa细胞；,配体结合域摘要：目的构建含有雌激素受体配体结合域的哺乳动物细胞杂交基因报告系统，研究黄芪注射液对雌激素受体ER活性的影响。方法PR扩增雌激素受体配体结合域，将配体结合域克隆到真核表达质粒pV-BD构建细胞杂交基因报告系统,研究黄芪注射液与雌激素受体的关系；TT法检测黄芪注射液对细胞活力的影响。结果成功构建含有雌激素受体配体结合域的哺乳动物细胞杂交基因报告系统，黄芪注射液不能进步细胞活性，但对雌激素受体具有激活作用。结论黄芪注射液可能通过雌激素受体发挥疗效，细胞杂交基因报告系统是研究中药作用

2、机理的手段之一。关键词：黄芪注射液；基因报告系统；雌激素受体；HeLa细胞；配体结合域AtivatingEffetfAstragalusInjetinnEstrgenReeptrAbstrat:bjetiveTestablishtheGal4DBD-ERrERLBDreprtsystetstudytheeffetfAstragalusInjetinnERs.ethdsGenereprtsysteasgeneratedbyaplifyingtheligandbindingdain(LBD)ithPfuplyeraseandsublningtheprdutinttheeukarytiexpress

3、invetrpVBD.ThissysteaseplyedtstudytherelatinshipbeteenAstragalusInjetinandERs.ellativityeredetetedbyTT.ResultsGenereprtersysteusingER-LBDisestablished.AstragalusInjetinanntiprveellativitybutanativateERsativatin.nlusinTheehanissfAstragalusInjetinayberelatedtitseffetfativatingERs.Genereprtsysteanbeuse

4、dtstudytheehanissfhinesetraditinalediine.Keyrds:AstragalusInjetin；GeneReprtsyste；Estrgenreeptr；HeLaell；Ligandbindingdain雌激素受体Estrgenreeptr,ER是一个核转录因子,属甾体激素受体家族成员，调控基因表达。ER在1967年被首次发现1，20多年来,它作为内分泌治疗的预测因子被广泛应用。1996年ER首次从大鼠中克隆2，其后人和小鼠也相继发现ER的表达3，4。ER和ER的构造、功能存在差异,在乳腺癌的发生开展中发挥不同作用5。因此研究药物对雌激素受体的作用，将有利于

5、我们认识药物的作用机理。黄芪主要有补气的作用,在临床上主要治疗以气虚为主证的疾病，在处方中多以君药出现,具有补中益气、补气升阳、益卫固表的作用。为了进一步讨论其作用机理，本研究采用哺乳动物细胞杂交技术研究黄芪注射液对雌激素受体配体结合域的作用，讨论黄芪对雌激素受体的局部作用。1材料与方法1.2PR扩增hERa-LBDDNA根据genebank报道的ERs序列12674和N001437，设计hERa-LBD和hERb-LBDDNA序列的引物,在5端引入一个BaH的酶切位点,在hERa-LBD的3端引入一个ER的酶切位点，在hERb-LBD的3端引入一个Hind的酶切位点，引物序列如下。上游5GG

6、GATGGAGGGAGAATGTTGAAA3下游5GGAATTTAGATGTGGAGGGAAA3；HuanERLBD引物序列：上游5GGGATGGAAGGAAGAGAAGTG3下游5GAAGTTTATGAGATGTGGGTT3。以xp-ERa和xp-ERb全长DNA质粒为模板进展PR反响。反响程序为：94,5in；94，1in；55，1in；72，2in；72，7in循环20次；PR产物进展1%琼脂糖凝胶电泳,用琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化并回收所需DNA片段,纯化的DNA溶解在50l的TE缓冲液中。1.3哺乳动物细胞表达质粒pV-hERLBD的构建用BaH和ERI双酶切PR产物,琼脂糖凝胶纯化试

7、剂盒回收纯化DNA，参加经一样双酶切处理、凝胶纯化回收的pV-BD载体，经过连接反响，构建成pV-Gal4hERaLBD和pV-Gal4hERLBD质粒。反响体系为：pV-BD2l(50ng),hERaLBD或hERLBD6l(100ng)，10连接缓冲液1l，T4DNA连接酶1l(3U)；16过夜连接；将1l连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,卡那霉素抗性挑选阳性克拢小量提取质粒,双酶切消化，1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性重组质粒并测定序列。1.4细胞培养胎牛血清采用haral-strip处理，人子宫癌细胞系Hela培养在含10%haral-Strip胎牛血清及抗生素青霉素100U/l,链

8、霉素100g/l的无酚红DE培养基中，37，5%2的二氧化碳培养箱潮湿培养。1.5TT检测黄芪注射液对Hela细胞增殖才能的影响细胞以104个/孔接种至96孔板，分成4组，每组12孔，利用含有10%胎牛血清的DE培养液培养24h之后，向培养液中分别参加不同浓度(0.001%，0.01%，0.1%)的黄芪注射液，继续培养24h。用噻唑蓝(TT)比色法测定细胞的增殖才能。1.6瞬时转染将处于对数生长期的细胞以104/孔传代于96孔细胞培养板中，培养过夜，长到80%90%满时用于转染。用优化培养液E稀释lipFetaine2000试剂0.5l/100l和质粒DNA。优化培养液稀释后质粒浓度分别为：p

9、V-Gal4hERaLBD和pV-Gal4hERLBD，25ng/孔;pFR-Lui,50ng/孔;pFRTlazeplasid,50ng/孔。lipFetaine2000稀释5in后，将稀释后的脂质体和质粒DNA等体积混合，于室温放置20in。迅速将细胞换液成含有10haral-Strip胎牛血清的无酚红DE100l。再参加脂质体/DNA混合物,将枪头深化液面下，逐滴参加，并轻轻摇摆混匀。1.7转染细胞的药物处理及检测将黄芪注射液溶于DS中，在细胞瞬时转染质粒6h后，分别参加不同浓度的黄芪注射液，并以DS为对照。放于52培养箱中继续培养24h，之后根据Prega公司Steady-Glkit说

10、明书测定细胞的荧光值，并以-Gal作为内标进展校正，测定-Gal活性。1.8数据处理用SPSS10.0统计软件包中的方差分析进展统计学处理，所有数据均用s表示,所有实验独立重复3次或3次以上。2结果2.1hERa-LBD和hER-LBD的PR扩增和序列测定扩增产物经1.5琼脂糖凝胶电泳，在1024bp和883bp处有特异性扩增条带，片段大小与预期值相符。结果见图1。序列分析结果显示得到的克隆基因序列与文献报道一致。：arkerDL2000A和B：ERaLBD和D：ERLBD图1PR产物琼脂糖凝胶电泳结果略2.2pV-Gal4hERaLBD和pV-Gal4hERLBD的酶切分析重组质粒pV-Ga

11、l4hERaLBD和pV-Gal4hERbLBD经限制酶BaH和ERIHindIII双酶切后，1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段与预期值相符。结果见图2。并将质粒送测序公司测序，测序结果分别与报道的hERaLBD和hERLBD序列一致。：DL2000arkerERa：pV-Gal4hERaLBD酶切结果ERb：pV-Gal4hERLBD酶切结果转贴于论文联盟.ll.图2pV-Gal4hERaLBD和pV-Gal4hERLBD经双酶切之后琼脂糖电泳图略2.3黄芪注射液对细胞增殖才能的影响HeLa细胞在高浓度0.001%0.1%黄芪注射液作用24h后，黄芪注射液不能进步细胞活力，低、高剂量与对

12、照组相比无统计学意义P0.05的差异。结果见图3。2.4黄芪注射液对雌激素受体配体结合域的激活作用通过Gal4DBD-ER和ERLBD细胞杂交报告系统，本研究发现，黄芪注射液可以在高剂量0.1%显著地进步ER的活性，但是小于0.01%的情况下无激活ER活性的作用，高、低剂量的黄芪注射液对ER均有明显的激活的作用。结果见图4。图3TT法检测不同剂量黄芪注射液对Hela细胞增殖才能的影响略a不同剂量黄芪注射液对ER的激活作用b不同剂量黄芪注射液对ER的激活作用图4黄芪注射液对ERs活性的影响略3讨论我国中药具有数千年的历史，而且平安性高、副作用低，因此具有很好的开展前景，但对中医药有效成分的分析与

13、研究还是处在早期阶段，使得我国中药的开展受到很大的限制，需要建立一个国际认可的、现代化的中药机理研究体系，来进展中药作用机理的研究。核受体家族根底研究的进展促进了新的受体病的发现,扩大了对激素抵抗机制的认识,为药物的设计和疾病的治疗提供了新思路6。核受体一般有6个功能区，其中与配体发生互相作用的是E/F区，核受体的配体结合域便有此区编码。雌激素受体是核受体中的一种，同样具有核受体的特征，具有与配体结合的配体结合域。因此可以通过细胞杂交基因报告系统，研究中药有效成分与雌激素配体结合域的互相作用，确定中药作为ER与ER选择性配体的功能，分析中药作为促效或拮抗药的机理。所以通过克隆雌激素受体配体结合

14、域构建细胞杂交基因报告系统对研究中药与雌激素受体的关系具有重要的作用。黄芪为豆科植物蒙古黄芪的根,主要化学成分为蕊异黄酮、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、黄芪皂苷，等，局部成分属植物雌激素类。中医认为黄芪注射液是具有益气养元、扶正祛邪、养心通脉、健脾利湿之功,主要用于治疗心气虚损、血脉痰阻之病毒性心肌炎、心功能不全及脾虚湿困之肝玻近年临床上还拓展应用于肝硬化、脑血管疾并肾脏疾病,对其抗肿瘤机制也进展了大量研究。机理之一是黄芪通过红细胞3b受体活性增加,免疫粘附功能增强,自然杀伤(NK)细胞具有广谱抗肿瘤活性,从而刺激体内免疫细胞进步机体抗肿瘤作用7，8。在本研究中，实验证明黄芪注射液并不能

15、显著地使Hela细胞增殖。利用高保真Taq酶克隆到两种雌激素受体亚型的配体结合域，并将其成功克隆到含有Gal4DNA结合域的真核表达质粒中，利用细胞杂交基因报告系统研究了黄芪注射液对雌激素受体的作用。发现黄芪注射液在高、低剂量下均可显著进步雌激素受体ER的活性，只有高剂量下才可激活雌激素受体ER的活性。由此推测，黄芪注射液可能是通过，至少局部通过雌激素受体发挥其促进细胞活力增加，并在治疗各种疾病中发挥疗效。文献报道蕊异黄酮、黄芪皂苷是生物活性较弱的雌激素,可以与人体ER结合形成ER2复合物,通过核内转录通路,即在细胞核内利用DNA反响元件的基因转录,翻译成效应蛋白,起到促进细胞增殖的生物学效应

16、,取代完好的雌激素反响9。黄芪因浓度不同分别起雌激素和抗雌激素的双相作用。低浓度(110-5110-8)l/L时表现出雌激素作用,而高浓度(110-4110-5)l/L时那么表现出抗雌激素作用。其类似雌激素作用是由ER介导的,标志是刺激肽合成酶2(PS2)RNA的表达;而抗雌激素作用并不由ER介导,在ER阴性细胞中仍然表现出抗增生作用10。本研究首先成功构建了含有雌激素受体配体结合域的细胞杂交基因报告系统，并成功研究了黄芪注射液与雌激素受体的关系，为将来中药作用机理的研究提供了一个新的思路和技术平台。参考文献：1TftD,ShyalaG,GrskiJ.Areeptrleulefrestrgen

17、s:studiesusingaell-freesysteJ.PrNatlAadSiUSA,1967,57:1740.2KuiperGG,EnarkE,Pelt-Huikk,etal.lningfanvelreeptrexpressedinratprstateandvaryJ.PrNatlAadSiUSA,1996,93:5925.3sselanS,PlanJ,DijkeaR.ER-:identifiatinandharaterizatinfanvelhuanestrgenreeptrJ.FEBSLett,1996,392:49.4TreblayGB,TreblayA,pelandNG,etal.lning,hrsallalizatin,andfuntinalanalysisftheurineestrgenreeptrJ.lEndrinl,1997,11:353.5SpEirsV,KerinJ.PrgnstisignifiganefestrgenreeptrbetainbreastanerJ.BrJSurg,2000,87:405.6徐仁宝.核受体家族研究的进展J.第二军医大学学报，2001，22(11)：1053.7任澎,程祖亨,马