藤梨根正丁醇提取物对人食管癌细胞生长作用的实验研究

1、藤梨根正丁醇提取物对人食管癌细胞生长作用的实验研究关键词藤梨根/猕猴桃根；食管肿瘤；抑制；凋亡Abstrat:bjetiveTevaluatetheinhibitryeffetfextratsfrAtinidiaargutabyn-butylalhlnhuanarinafesphagusells(Ea-109).ethdsTTlretriassayasusedtexainethegrthinhibitinfextratsfrAtinidiaargutabyn-butylalhlnEa-109ells,TUNELtestasperfredtbservetheapptsisinduedbythee

2、xtrats(1g/l、10g/l、100g/l)nEa-109ells.ResultsTheinhibitryeffetftheextratsnEa-109ellsasinreasedinadse-andtie-dependentanner.TheextratsuldsignifiantlyindueapptsisfEa-109ells.nlusinTheextratsfrAtinidiaargutabyn-butylalhluldeffetivelyinhibitEa-109ellgrth.Keyrds:Tengligen/atinidiaarguta;Esphagustur;Inhibi

3、tryeffet;Apptsis细胞凋亡是由基因编码控制的一种细胞的程序性死亡，是机体维持正常生理活动所必需的。近年发现细胞凋亡在许多疾病尤其在肿瘤的发生、开展及转归中起着重要作用，这为肿瘤病人的治疗提供了新的思路。随着中医药对肿瘤治疗的大量临床观察及实验研究的深化,人们逐渐肯定了它对肿瘤治疗方面的疗效。其抗肿瘤作用机制有多方面，如抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制蛋白酪氨酸激酶prtEintyrsinekinase,PTK活性等1-4。藤梨根又称阳桃根，为植物猕猴桃科藤梨软枣猕猴桃Atinidiaarg-uta(Sieb.teZu.)Planh.或猕猴桃A.hinensisPlanh.的根。研

4、究说明，藤梨根对多种肿瘤细胞有生长抑制作用，采用不同方法所得的提取物其抑制作用存在一定的差异5-6。本文通过观察藤梨根对培养的人食管癌Ea-109细胞生长的作用，以讨论藤梨根对人食管癌细胞的作用机制。1材料与方法1.1材料人食管癌细胞Ea-109细胞株购于上海市中科院细胞库，RPI-1640培养基购于武汉天源生物技术，为Gib公司产品(货号31800-022)；超级新生牛血清为杭州四季青生物工程产品(批号050126)；实验用1250胰酶购于武汉天源生物技术，为Dif公司产品(批号020411)；四甲基偶氢唑蓝(TT)购于武汉天源生物技术，为Duhefa分装(货号BS0880)；二甲亚砜(DS

5、)购于武汉天源生物技术，为Siga公司产品。TUNEL试剂盒(编号ZK-8005)购于北京中杉生物技术。1.2细胞培养细胞在含10%小牛血清的RPI1640培养液中，37、5%2条件下培养，24h换液一次。1.3药物制备将藤梨根1kg粉碎成粗粉，烘干备用。取藤梨根500g，参加3000l正丁醇中浸泡12h；回流提取1h，过滤；药渣再加2000l正丁醇回流提取1h；合并两次滤液，减压回收正丁醇至稠膏状，真空枯燥；枯燥品加蒸馏水500l，旋转加热溶解，制成饱和水溶液；灭菌；原液(500l，1g/l，pH=3.8)。将原液稀释成1g/l、10g/l、100g/l三个药物浓度；过滤；灭菌；分装，置4冰

6、箱备用。1.4TT法将贴壁细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后计数，调整细胞浓度为4104/l，接种于96孔板，待24h细胞贴壁后参加藤梨根正丁醇提取物药液。实验组分别参加终浓度为1g/l、10g/l、100g/l3个药物浓度的药液，对照组参加等体积溶剂的培养液，每组l2复孔，分别于加药后第1、2、3d测定各孔的吸光度值(A值)。测定前每孔加5g/l的TT20l，温育4h，弃上清液，参加二甲基亚砜(DS)150l/孔。同时振荡至结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪在490n波长下测定A490值。用各组的平均A值计算细胞生长抑制率。生长抑制率=对照组A值实验组A值/对照组A值100%。1.5TUNEL法检

7、测凋亡细胞将浓度为4104/l的Ea-109细胞接种于经多聚赖氨酸包被的干净盖玻片上，用RPI1640培养基于37、5%2条件下在24孔板中培养24h后取出盖玻片，PBS冲洗3次。0.1%Tritn-100破膜、4%多聚甲醛固定，H22阻断。用TDT法将生物素标记的d-UTP在末端转移酶的作用下，标记到DNA的5端缺口上，再用亲和素标记的HRP与之结合，然后参加底物DAB显色，苏木素复染，从而使凋亡细胞核呈现棕褐色，未凋亡细胞核呈蓝色。在光学显微镜下随机计数5个高倍视野约1000个细胞中的凋亡细胞数,计算凋亡细胞所占比例。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1TT法检测生长抑制率结果说明藤梨根正丁

8、醇提取物对人食管癌Ea-109细胞的生长抑制作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强。用1g/l的正丁醇提取物作用24h，细胞生长抑制率为18.5%；当延长至72h时，抑制率上升至45.3%；而100g/l的药物作用72h时，可使85%以上的细胞生长受到抑制见表1。表1藤梨根正丁醇提取物对Ea-109细胞的生长抑制率略2.3TUNEL法检测细胞凋亡当用1g/l藤梨根正丁醇提取物处理Ea-109细胞24h时，可检测到形态尚未发生改变的早期凋亡细胞；当药物作用时间延长至72h时，可见凋亡细胞变圆，体积明显缩小，核染色质浓缩，变成新月形，此为晚期凋亡细胞，随时间的推移，凋亡细胞比例逐渐增加见图1

9、。而对照组，未见有明显凋亡现象见图2。3讨论肿瘤是危及人类生命的首要顽疾，药物治疗为中西医肿瘤治疗中的一个重要形式，包括化学药物和天然药物。中医药的抗肿瘤作用已得到广泛的肯定，其机制有多方面，如抑制DNA合成、抑制肿瘤血管形成、诱导细胞分化、促进细胞凋亡、调节机体免疫功能、抑制蛋白酪氨酸激酶prtEintyrsinekinase,PTK活性等1-4。关于藤梨根的研究已有报道，其对消化系统肿瘤有良好的抗肿瘤作用，可用于消化系统肿瘤的治疗5，但其抗肿瘤作用机制还不清楚。初步研究发现，同种猕猴桃根不同提取方法所得的提取物其抗肿瘤作用可能不尽一样。有学者用甲醇、水、乙酸乙酯、正丁醇等溶剂回流提取,观察

10、提取物对同种肝癌细胞株的作用,结果说明正丁醇、乙酸乙酯提取物对瘤细胞的生长有较好的抑制作用,但各组量效关系不明显6。关于藤梨根提取物中抗肿瘤作用的成分,曾有人报道主要为三萜类化合物,分别为乙酸乙酯提取物熊果酸、-谷甾醇及正丁醇提取物2,3,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸、2,3,23-三羟基-12-烯-28-乌苏酸、24-hydrxytrentriaid7。研究说明，藤梨根对多种肿瘤细胞生长均有抑制作用。钟振国8等采用TT比色法、集落形成法等方法对藤梨根作用的宫颈癌细胞株Hela、神经肿瘤细胞株NG108-15、胃癌细胞株SG7901等进展了研究，结果藤梨根对不同瘤细胞的生长均有不同程度

11、的抑制作用。李昊9等研究了藤梨根对人胃低分化腺癌BG-823细胞的作用，发现其浓度在1.3g/l时抑瘤率最强(88.19%)，随着药物浓度的降低，抑瘤率随之下降；藤梨根对胃癌细胞作用24h抑制作用最强(87.6l%)，48h回落，72h再次上升,其对胃癌细胞有明显杀伤作用。卫培峰10等在动物实验中证明藤梨根能有效诱导鼠胃癌细胞的凋亡,与对照组细胞的凋亡率和死亡率有显著的差异。近几年来，国内外对细胞间隙连接通讯与癌变的关系进展了大量的研究，发现多数肿瘤细胞无此功能，其间隙连接少或无，而邻近的正常组织或良性肿瘤的间隙连接正常，少数肿瘤细胞有脆弱的连接通讯，但很容易受到破坏，其间隙连接数量很少，藤梨

12、根可以通过上调细胞间隙连接通讯功能来抑制某些肿瘤细胞如高转移性人肺癌细胞的生长11。本研究结果证实：藤梨根正丁醇提取物三个药物浓度1g/l、10g/l、100g/l作用于Ea-109细胞24h、48h、72h后，显示出明显的凋亡特征。TUNEL法可检测到不同时期的凋亡细胞；TT法也发现随药物浓度升高和作用时间的延长,其抑制率明显升高。因此推测，诱导肿瘤细胞凋亡可能是藤梨根抗肿瘤作用的机制之一。但细胞凋亡的调控及信号传导极其复杂，有多种分子参与。故抗肿瘤作用的真正机理及体内抑瘤实验尚需进一步深化研究。(文中图12见封四)略参考文献1黄河，刘宗潮.紫草素及其衍生物的抗肿瘤作用J.肿瘤防治杂志，20

13、22，121：75-78.2马桔祥,王勤忠,苏军英,等.大豆异黄酮诱导人食管癌裸鼠移植瘤细胞凋亡J.中国肿瘤,2022,13(1):34-37.3hnS,Tahibana,Shibakita,etal.PrgnstisignifianefFasandFasligandsyste-assiatedapptsisingastrianerJ.AnnSurgnl,2000,7(10):750-757.4NiY,Iguhi,YaasaaK,etal.ApptsisandexpressinfBl-2andBaxprtEInsininvasivedutalarinafthepanreasJ.Panreas,2001,22(3):230-239.5江苏新医学院主编.中药大辞典下册.上海：上海科学技术出版社，1997：2210-2211.6韦金育，曾振东，吕琳,等.中越猕猴桃根提取物抗肿瘤作用的实验研究J.广西中医药，2022，266：49-50.7覃益民，黄初升，陈希慧,等.中越猕猴桃根三萜成分的研究J.中草药，1999，305：323-326.8钟振国，张雯艳，张凤芬,等.中越猕猴桃根提取物的体外抗肿瘤活性