通脉口服液对气虚血淤证单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质病变的影响

1、通脉口服液对气虚血淤证单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质病变的影响【摘要】目的讨论益气活血复方通脉口服液对气虚血淤证肾小管间质病变的干预作用。方法istar大鼠60只，随机分为空白组，模型组，洛汀新治疗组，通脉大、中、小剂量治疗组。采用单侧输尿管梗阻(UU)+亚急性衰老+游泳力竭致气虚血淤证肾小管间质病变病证结合模型，予相应药物治疗4周，观测体质量等一般状况，进展中医气虚证、血淤证评分，化学法检测血清BUN、Sr含量，ELISA法检测血组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)含量，对病变肾组织进展间质细胞浸润情况评分(IS)及肾小管间质慢性病变评分(AFS)。结果模型

2、大鼠体质量显著下降，气虚证、血淤证积分显著增高，通脉大、中剂量组大鼠体质量显著改善(P0.05)，通脉各剂量组大鼠气虚证、血淤证积分显著降低;模型组大鼠PAI-1及t-PA/PAI-1显著升高(P0.01)，通脉大剂量组PAI-1显著下降(P0.01)，通脉中剂量及洛汀新组PAI-1明显下降(P0.05);通脉大剂量组梗阻肾IS、AFS显著降低(P0.05)，降低前者与络汀新组相当，降低后者那么优于络汀新(P0.05)。结论通脉口服液大、中剂量可改善气虚血淤证肾小管间质病变大鼠体质量、气虚证、血淤证、血PAI-1升高等整体表现，大剂量通脉可明显减轻肾小管间质病理改变，且在对抗肾小管间质慢性病变

3、方面优于洛汀新。【关键词】通脉口服液;气虚血淤证;肾小管间质病变慢性肾脏病(KD)是世界范围的医疗和公共卫生问题。长期以来，对其研究主要集中于肾小球病变，肾小管间质病变(Tubulinterstitiallesins，TIL)未得到足够重视。随着人类肾脏疾病病理改变和肾病变动物模型研究的深化，提示KD的开展和预后不仅与肾小球病变有关，更取决于TIL的有无及程度的轻重1。以杨霓芝教授为代表的学科组研究说明气虚血淤证为KD最常见证侯之一，通过十余年的临床与实验研究，证明具有益气活血成效的中药复方通脉口服液(T)可通过多种机制改善KD预后2。因此进一步开展其对气虚血淤证UU大鼠TIL干预作用的实验研

4、究，完善其机制讨论。1材料与仪器1.2药物与试剂通脉口服液(由黄芪、三七等制成)由广东省中医院制剂中心提供(批号：06080709，规格：10l10支)。对照药物：洛汀新(苯那普利)，北京诺华制药消费(批号：H20220514，规格：10g14片)。t-PA、PAI-1检测试剂盒：美国USNlifeSieneandtehnlgypany消费，广州威佳科技公司提供。1.3仪器7170A全自动生化分析仪：日本日立;ElipseE800型光学显微镜：日本Nikn公司;DG5033A酶标仪：南京华东电子公司。2方法2.1分组与造模方法适应性饲养7d后将大鼠随机分为2组，空白组(A)10只，造模组50只

5、，后者复制气虚血淤证UU模型。造模方法：衰老：采用D-半乳糖亚急性衰老方法3，第748天注射D-半乳糖(150g/kgd);疲劳：采用游泳力竭方法4，第734天每日9：00开场分批置入直径50，高100水桶内，桶内水深45，水温与室温均保持为(150.5)，以木棒拔打强迫其不断游泳直到力竭(标准为动物下沉后10s不露出水面);UU:参考文献5方法，第37天5%水合氯醛麻醉成功后，常规消毒，腹正中线切口，游离肾脏及输尿管，将左侧输尿管用组织钳托起中段部位，止血钳夹住，在两端用4-0丝线结扎(近肾盂段两次结扎)后剪断，关腹缝合。术后存活大鼠随机分为模型组(B)，洛汀新治疗组(),T大、中、小剂量治

6、疗组(D、E、F)。A组大鼠第748天等量生理盐水皮下注射，第34天行假手术处理，手术方式同UU组，但在进腹腔后别离左输尿管后不结扎。2.2给药方法第3460天、B组生理盐水12l/kgd灌胃，组洛汀新2g/Kgd灌胃，D组大鼠T(12l/kgd)灌胃，E组8l/kgd(生理盐水稀释至12l/kgd，下同)灌胃，F组4l/kgd灌胃。2.3取材及处理方法第60天所有大鼠5%水合氯醛麻醉后，腹主动脉取全血6l，低温离心别离血清(4，3000r/in，10in)，-20保存。游离左肾，扇形切取局部肾组织，10%中性甲醛溶液固定。2.4检测指标与方法2.4.1治疗前后中医证候积分评定参考文献6方法分

7、别于第33，57天对各组大鼠进展证候积分评定。气虚证评分：A：精神正常(0)、精神萎顿(3)、倦怠嗜睡(5)、对抗性、攻击性完全消失(7);B：毛发正常(0)、毛发枯黄无光泽(3)、毛发结穗打卷(5)、毛发稀疏脱落(7);：大便正常(0)、轻度稀便(3)、中度稀便(5)、重度稀便或黄绿褐色黏臭便(7)。大鼠血淤证评分：A：舌质红润(0)、舌质暗淡(3)、舌质绛紫(5);B：眼球淡红(0)转为深红(3)、转为暗红(5)，：尾尖至根部无淤点淤斑(0)、出现轻度淤血点(3)、出现中度以上淤斑(5)。2.4.2血清指标的测定血肌酐检测采用苦味酸法，血尿素氮检测用尿素酶法，ELISA法检测血清内t-PA

8、、PAI-1含量。2.4.3梗阻肾组织病理学检查梗阻肾进展大体观察后，固定，包埋，制成4切片，HE及assn染色，光镜下观察TIL。参考文献方法7进展肾间质细胞浸润情况评分(ellinfiltratinsre，IS)：间质细胞浸润：无(0)、局灶细胞浸润(1)、多灶细胞浸润(2)、弥漫细胞浸润(3)。肾间质慢性病变(包括肾小管萎缩和间质纤维化)评分(Atrp-hyandfibrsissre，AFS)：间质纤维化：无(0)、视野区域25%(1分)、视野25%50%(2)、视野50%(3);肾小管萎缩：无(0)、视野区域25%(1)、视野25%50%(2)、视野50%(3)。由两个观察者对每个肾组

9、织样本200倍光镜下随机取互不重叠的10个视野进展盲法评分，取两观察者评分的平均值,代表各样品的TIL程度。2.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件包建立数据库，数据采用s表示，采用方差分析和q检验进展统计分析。3结果3.1各组大鼠一般状况A组及D组各有1只大鼠在UU手术过程中死亡，原因为麻醉意外。B组死亡1只，原因为游泳力竭实验过程中溺死。实验完毕时，A组大鼠精神状况良好，动作自如，反响灵敏，毛皮有光泽;B组、F组大鼠明显消瘦，大便溏，精神萎靡，反映迟钝，毛竖，无光泽，动作缓慢。通脉各治疗组一般状况较模型组有不同程度改善。实验完毕时，各造模组大鼠体重明显下降(P0.01)，与B组相比，通

10、脉大、中剂量组体质量明显增加(P0.05)。见表1。表1各组大鼠体质量变化与空白组比拟，*P0.01;与模型组比拟，P0.053.2各组大鼠治疗前后中医证候积分治疗前造模各组与A组相比气虚证、血淤证积分值明显升高(P0.01);治疗后D、E、F组气虚证、血淤证积分值较B组、组明显降低(P0.05或P0.01)，D、E、F组之间无显著性差异。见表2。表2治疗前、后各组气虚证、淤血证积分比拟与空白组比拟，*P0.01;与模型组比拟，P0.05、P0.013.3各组大鼠血肌酐、尿素氮、t-PA、PAI-1变化治疗完毕时各造模组BUN、Sr与空白组无统计学差异。与A组相比，B组PAI-1及显著升高(P

11、0.01);各治疗组与B组比拟，D组PAI-1显著下降(P0.01)，、E组PAI-1明显下降(P0.05)。见表3。转贴于论文联盟.ll.3.4各组大鼠肾脏组织病理学造模大鼠左侧肾脏明显增大成球形，色泽紫暗。A组HE染色可见：正常肾小球和肾小管间质，肾小管由单层立方上皮组成，胞体较大，细胞核圆形，位于细胞近基底部。assn染色可见肾小球、肾小管基底膜明晰可见。模型组大鼠HE、assn染色可见：大局部肾小管上皮细胞颗粒、空泡变性，局部肾小管上皮细胞坏死脱落，呈裸基底膜，管腔扩展，局部管腔内可见脱落坏死组织及细胞形成颗粒管型及细胞管型，可见灶性肾小管萎缩;间质区明显增宽，炎性细胞浸润，纤维组织增

12、生，呈条索状、片状纤维化;肾小球除局部有肾小囊轻-中度扩张外，无其他明显病变(图14)。通脉各剂量组和西药组也有以上类似的改变，但病变与模型组相比有不同程度的减轻。表3治疗后各组大鼠血清t-PA、PAI-1含量3.5各组大鼠肾小管间质IS及AFS积分情况与A组相比，各造模组IS均明显增高(P0.001);与B组比拟，D与组下降明显(P0.01)，两者之间无显著差异(P0.05)。与空白组相比，各造模组大鼠AFS均明显增高(P0.001);与B组比拟，组AFS降低明显(P0.05)，D组降低显著(P0.001)，且较组明显下降(P0.05)。见表4。表4治疗后各组大鼠肾小管间质IS、AFS与空白

13、组比拟，*P0.001;与模型组比拟，P0.001，P0.05;与洛汀新组比拟，P0.05，P0.054讨论TIL最终可导致肾间质纤维化(RIF)，后者几乎是所有KD开展到后期的病理学特征。通过早期防治TIL以阻止RIF的进展进而改善KD的预后具有重大意义。研究说明,血管紧张素转换酶抑制剂等药物具有一定保护作用8，中医药防治TIL的研究业已获得了不少有意义的研究结果。我们前期应用具有益气活血成效的中药复方制剂T用于治疗具有气虚血淤证的KD,疗效明确。因此进一步设计动物实验讨论T的疗效与干预TIL的相关性，并设大、中、小剂量组及AEi类代表药物洛汀新作为对照，以期初步明确其量效关系及作用特点。当

14、前中医药干预TIL的动物实验研究，大都直接采用现代医学模型，其中单侧输尿管梗阻(UU)应用最为广泛。但中医药现代化及中西医结合事业迫切需要真正具有中医证候特点的病证结合模型9。杨霓芝教授在肾脏病研究领域率先采用抗Thy-1+游泳疲劳试验造成的大鼠慢性肾炎“气虚血淤证病证结合模型10。在此根底上，本实验TIL动物模型，采用了UU结合亚急性衰老及游泳疲劳的复合因素造模方法。结果显示：梗阻侧肾组织发生典型TIL，说明“脖的复制是成功的。造模后在宏观“证方面，模型组较空白组大鼠体重下降，并出现了精神萎顿、毛发枯黄无光泽、稀便、舌质暗淡、尾尖至根部出现淤血点、梗阻侧肾色泽紫暗等“气虚血淤证表现;在微观“

15、证方面，我们监测了纤溶酶原激活剂/纤溶酶原激活剂下抑制物(PAs/PAIs)这对指标，其不仅是维持血液中凝血与纤溶平衡的关键酶系，同时为调节肾脏细胞外基质代谢的关键酶系之一11，PA程度下降、PAI程度上升或其比值下降与淤血证有一定相关性11，12。本实验结果显示与空白组相比，模型组PAI-1显著升高，在一定程度上提示该模型具有微观的血淤证。实验结果说明，应用益气活血中药T灌胃后大鼠体质量、“气虚证、“血淤证血清PAI-1升高得到不同程度改善，洛汀新改善不显著，提示益气活血中药T的多靶点、多途径的药理作用可能有助于改善衰老、疲劳、输尿管梗阻对大鼠造成的“气虚血淤综合病理改变，这为临床上应用T等中药制剂治疗KD,在改善患者整体表现方面优于洛汀新等西药提供了实验根据。同时以方测证，本实验在气虚血淤证的复制是比拟成功的。病理学是研究肾小管间质病变的最直观、最有说服力的指标，本研究对实验大鼠梗阻肾病理切片行HE、assn染色，通过对大鼠肾小管间质慢性病变和肾间质细胞浸润情况进展盲法观察评分。结果