骨髓血管内皮祖细胞的分离培养及分化鉴定

1、骨髓血管内皮祖细胞的别离培养及分化鉴定【摘要】目的研究别离、培养小鼠骨髓血管内皮祖细胞的方法并对其进展诱导分化鉴定，为临床进展缺血性疾病的替代治疗奠定细胞学基矗方法用灌注法别离小鼠骨髓血管内皮祖细胞，用血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子诱导其分化，形态学观察细胞的生长过程，并利用抗D34抗体鉴定血管内皮祖细胞，利用抗vF抗体、抗eNS抗体鉴定血管内皮细胞。结果小鼠骨髓血管内皮祖细胞可在体外培养条件下贴壁生长，可诱导分化为表达特异性组织蛋白的内皮细胞。结论在小鼠骨髓内可别离出骨髓源性血管内皮祖细胞，呈贴壁增殖状态，并有分化才能。【关键词】血管内皮祖细胞;血管内皮细胞;骨髓源性;分化【Keyrd

2、s】Endthelialprgenitrells;Endthelialells;Spinalrd;elldifferentiatin骨髓中的血管内皮祖细胞(Endthelialprgenitrells，EPs)可以游走到创伤组织参加新血管形成，并能分化为内皮细胞(Endthelialells，Es)，促进部分血管生成和血管新生。目前已有研究者将EPs用于治疗缺血性疾病，并获得了良好的治疗效果，具有再生和分化才能的EPs已逐渐成为治疗血管系统疾病的理想细胞材料1。但是，目前EPs主要通过外周血进展提取，这种方法获取的细胞数量较少，而骨髓来源的EPs研究报道不多。本研究从BALB/小鼠别离骨髓源性

3、EPs，在体外进展培养扩增，诱导其分化，建立一套完好的骨髓源性EPs的别离、培养、诱导分化和鉴定的方法，为其作为细胞材料治疗血管创伤方面提供根据。1材料与方法1.1实验材料BALB/小鼠，68龄，雌雄不限，由吉林大学医学部根底实验动物部提供，SPF级;DE/F12(11)培养基、胎牛血清由Gib公司提供;内皮细胞生长因子(epideralgrthfatr，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basifibrblastgrthfatr，bFGF)由Siga公司提供;纤维连接蛋白(FN)由北京鼎国公司提供;抗D34抗体、抗vF抗体、抗eNS、SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒由博士德公司提供;6孔

4、一次性培养板、10一次性培养皿由sta公司提供。1.2EPs的别离与培养2BALB/小鼠断颈处死后，置于75%酒精浸泡灭菌5in。无菌条件下别离股骨，去除肌肉组织，用1l注射器汲取1l无血清DE/F12培养基，从股骨一端进针进展冲洗，反复3次，充分冲出骨髓组织，用200目不锈钢筛网进展碾压，别离成单个细胞。用无血清DE/F12离心，弃上清液，2l无血清培养液重悬细胞参加到淋巴细胞别离液上离心，1500r/in，30in。用吸管吸出中间白色云雾状细胞带，培养液洗涤2次。用DE/F12培养液(为根底培养基，bFGF和VEGF终浓度均为10ng/l)调节细胞终浓度为5105/l，接种到预铺有纤连蛋白

5、10培养皿，37、5%2培养箱中进展培养，每3天换液1次。1.3EPs的诱导分化鉴定3将培养细胞接种于预先置有盖玻片(多聚赖氨酸处理过)的6孔培养板中进展培养，并参加含bFGF和VEGF的DE/F12培养基进展诱导分化，于4、20d后分别用丙酮固定，进展免疫细胞化学染色观察EPs的分化。详细步骤如下：3%H22水孵育510in，以消除内源性过氧化物酶活性;滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育1015in，倾去，勿洗;滴加1100的一抗37孵育3h，PBS冲洗(3in3次);滴加兔抗大鼠二抗，37孵育10in，PBS洗(3in3次);滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37孵育10in，PBS冲洗

6、(3in3次)。DAB显色，显微镜下控制显色时间，自来水充分冲洗,脱水,透明,中性树脂封片并镜检。2结果2.1骨髓源性EPs的培养从骨髓别离的细胞接种于培养基后，约2d开场贴壁，呈梭样或三角形样增长，4d后细胞生长速度开场增快，约10d开场出现集落样生长状态，有梭形细胞从集落伸出，互相连接成片(图1)，约1820d细胞互相交融，呈铺路石样状态。2.2EPs及Es的细胞免疫化学鉴定未加VEGF和bFGF的EPs免疫化学染色显示D34阳性反响,培养的部分细胞外表上带有均匀的棕色颗粒(图2A)。培养10d经VEGF和bFGF诱导后，部分细胞vF和eNS染色均呈阳性(图2B，图2)。3讨论当前，和老龄

7、化亲密相关的动脉粥样硬化、脑缺血、心肌缺血、脑梗死和心肌梗死等疾病发病率日益增高。研究发现，在这些疾病的恢复过程中，高龄老化引起机体血管发育才能障碍，血管生长因子合成减少，血管内皮细胞功能异常，对细胞因子的反响力也下降。目前已有动物实验研究移植EPs治疗动脉粥样硬化和脑梗死，增加内皮细胞在这些疾病血液循环中的发动及增殖，结果说明内皮祖细胞对治疗这两种疾病有着积极的作用46。转贴于论文联盟.ll.EPs主要来源于骨髓、外周血、脐血和胚胎，而到目前为止获取EPs的研究大多集中在从外周血中提取,骨髓来源的EPs研究报道为数不多。因此，本实验的目的就是从骨髓中别离培养大量EPs，使其作为种子细胞进展移

8、植用于缺血性疾病的细胞替代治疗和基因治疗。细胞培养体系中细胞因子组成成分的不同可影响别离的单个核细胞的生长和分化。本研究中应用了细胞因子VEGF和bFGF作为EPs的诱导分化剂。VEGF是一种可以与肝素结合的高选择度的促内皮细胞分裂素，可促进内皮细胞增生，体外培养中在一定范围内VEGF的浓度和EPS的生长率呈正相关7。bFGF和VEGF有协同作用，主要促进内皮细胞的增殖和移行，使之增生出毛细血管样的构造，促进新生血管的产生8。两者的结合应用促进了别离的单个核细胞向内皮系统的生长和分化，证实了这是一种可行的EPs培养方法。D34抗原是一种表达于细胞外表的糖蛋白，随着幼稚细胞的分化成熟，其表达程度逐渐下降，是EPs的标志物之一9，本实验获得的培养4d的EPsD