花边莲提取液对人肺癌SPC

1、花边莲提取液对人肺癌SPC【关键词】花边莲；,SP摘要：目的讨论花边莲提取液对人肺癌SPA1细胞凋亡相关基因survivin和aspase3表达的影响。方法采用体外培养人肺癌SPA1细胞，实验随机分为正常对照组、花边莲处理组浓度分别为12.5，25和50l/L和顺铂DDp25g/L组，半定量RTPR检测survivin和aspase3RNA表达程度，二步法免疫组化检测Survivin和aspase3蛋白表达变化。结果与正常对照组相比，花边莲各浓度组aspase3RNA和蛋白表达显著上升P0.01，survivinRNA和蛋白表达明显下降P0.01。结论花边莲提取液诱导SPA1细胞凋亡的分子机理

2、可能与上调aspase3基因表达和下调survivin基因表达有关。关键词：花边莲；SPA1细胞；细胞凋亡；survivin;aspase3InfluenefHuaBianLianExtratnExpressinfApptsisAssiatedGenesSurvivinandaspase3inHuanLunganerSPA1ellsAbstrat：bjetiveTinvestigatetheinfluenefHuaBianLian(HBL)extratnexpressinfapptsisassiatedgenessurvivinandaspase3inhuanlunganerSPA1ells.

3、ethdsulturedhuanlunganerSPA1ellsererandlydividedintthentrlgrup(thenegativentrlgrup),HBL-treatedgrups(12.5,2.5,50l/L)andDDP(25g/L)grup(thepsitiventrlgrup).Theexpressinfsurvivinandaspase3RNAasdetetedbyseiquantitiveRTPR.Theexpressinfsurvivinandaspase-3prtEinseredetetedbytstepiunhistheialstaining.Result

4、sparedithntrlgrup,theexpressinfaspase3RNAandprtEIninreasedsignifianty(P0.01),hilesurvivinRNAandprteindereasedarkedlyinHBLgrups(P0.01).nlusinTheleularehanisfHBLapptsisinduingfSPA1ellsaybeassiatediththeupregulatingexpressinfaspase-3geneanddnregulatingexpressinfsurvivingene.Keyrds：HuaBianLian;SPA1ells;

5、Apptsis;Survivingene;aspase3gene前期研究说明，中药复方花边莲HuaBianLian,HBL提取液对人肺癌SPA1细胞具有较强的增殖抑制和诱导细胞凋亡作用1，但其作用机理尚不明确。大量研究证据说明，细胞凋亡调节机理是多种基因互相作用、综合调节的结果。生存素Survivin是最近发现的凋亡抑制蛋白inhibitrsfapptsisprtein,IAP，它通过直接作用于细胞凋亡途径中的终末效应酶半胱氨酸蛋白酶aspase3和aspase7阻断细胞凋亡途径2。aspase3与凋亡关系最为亲密，参与多种因素诱导的细胞凋亡。本实验观察HBL提取液对人肺癌SPA1细胞凋亡相关

6、基因survivin和aspase3表达变化的影响，讨论该药方抗肿瘤作用的可能分子机理。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞人肺癌SPA1细胞株由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供。1.1.2试剂与仪器胎牛血清FBS、RPI1640培养基为GIB公司产品，顺铂DDP为锦州九泰药业有限责任公司产品，RNA提取试剂盒为BIDEVTEH公司产品，AessRTPRsyste为Prega公司产品，PR引物为上海生工生物工程公司合成，鼠抗survivin(D8)：s17779和aspase3(E8)：s7272单克隆抗体为Santaruz公司产品，PerVisinT免疫组化检测试剂PV6001/6002为

7、北京中杉金桥生物技术公司产品。倒置显微镜i，BX51型显微镜LYPUS，PR仪杭州郎基。1.2方法1.2.1HBL提取液的制备取白花蛇舌草、半枝莲、半边莲和白英等购置于江西南华医药中药材分公司，产地江西干品100g，用1000l水浸泡1h，加热煮沸后小火煎熬60in，室温冷却，120目网筛过滤，弃药渣，滤液离心3000r/in，20in，2次。取上清液，浓缩至50l，调pH值为7.07.2，0.22过滤除菌，获生药含量为2.0g/l白英水提液，5l小瓶分装，-20保存备用，实验时将含10%胎牛血清RPI1640培养液稀释至所需的药物浓度。1.2.2细胞培养和药物处理SPA1细胞，以含100U/

8、l青霉素、100g/l链霉素、10%FBS的RPI1640培养液，在37，5%2的培养箱中培养，细胞生长至对数增殖期，更换含0，12.5，25，50l/LHBL新颖培养液，用DDP25g/L为阳性对照组，药物作用时间为48h。1.2.3半定量RTPR检测survivin和asapse-3RNA表达药物处理细胞48h后，搜集各组细胞，PBS冲洗两次，按总RNA提取试剂盒的说明书提取RNA。引物借助prierpreier5.0软件设计，并经Genebank验证。survivin引物：Sense：5TTAAGGAAGATT3，Anti-sese：5GGTTTTTTGTAGTTTA3，扩增产物长度28

9、9bp；aspase-3引物：Sense:5-GGTTTTTTGTAGTTTA-3，Anti-sese:5AATGTGATTAGAGG3,扩增产物长度270bp;-atub引物：Sense：5-AATGTGATTAGAGG-3，Antisense：5AGGGGGGATGTATAT-3，扩增产物长度621bp。按试剂盒说明采用一步法进展RTPR。反响体系总体积50l，逆转录4545in，AVRT灭活和预变性942in，然后进展PR35个循环9430s，551in，722in，最后延伸727in，终止于4。各取PR产物10l,加溴酚蓝指示剂2l，于1.5%琼脂糖凝胶上电泳约1h电压90V，然后用紫

10、外透射分析仪观察结果并拍照，并通过凝胶图像密度扫描仪扫描分析各条带的光密度，以atin的表达量为对照计算并比拟各组survivin和aspase3的相对表达量。1.2.4免疫组化法检测Survivin和aspase3蛋白表达按照二步法免疫组化检测试剂盒说明书操作：药物处理细胞48h后，搜集各组细胞，PBS冲洗两次，制成细胞悬液涂片，风干后丙酮固定15in；3%过氧化氢孵育5in，以阻断内源性过氧化物酶；滴加一抗稀释1100，室温90in，PBS冲洗，2in3次；滴比IgG抗体HRP多聚体2030in。以PBS冲洗，2in3次；以PBS代替一抗作为阴性对照。结果分析：Survivin和aspas

11、e3蛋白定位于胞浆，细胞浆染为棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。利用LAS彩色病理图像分析系统北京航空大学空军总医院研制进展分析。随机计数低倍镜下10个视野中的阳性细胞占该视野细胞总数的比率，得出每组细胞的阳性率。1.2.5统计学方法实验数据采用s表示，用SPSS10.0统计软件进展统计学处理，参数统计采用t检验。转贴于论文联盟.ll.2结果表1Survivin和aspase3蛋白表达变化略与对照组相较P0.01；n=102.1HBL提取液对SPA1细胞survivinRNA和aspase-3RNA表达的影响药物处理SPA1细胞48h后，随着HBL提取液浓度的升高，RTPR产物琼脂糖凝胶电脉显示s

12、urvivin基因条带逐渐变细变暗，见图1，aspase3基因条带逐渐变粗变亮，见图2；3次结果经光密度扫描分析可见：survivin/atin光密度积分值之比随HBL提取液浓度增加而呈逐渐降低的趋势P0.01，aspase3/atin光密度积分值之比随HBL提取液浓度增加而逐渐增高的趋势P0.01，见图34。.DNAarkerA.ntrlB.12.5l/LHBL.25l/LHBLD.50l/LHBLE.25g/LDDP图1RTPR检测survivin基因RNA表达略.DNAarkerA.ntrlB.12.5l/LHBL.25l/LHBLD.50l/LHBLE.25g/LDDP图2RTPR检测

13、aspase3基因RNA表达略与对照组比拟，P0.01；n=3图3survivinRNA表达结果survivin/-atin略与对照组比拟，P；n=3图4aspase3RNA表达结果aspase3atin略2.2HBL提取液对SPA1细胞Survivin和aspase3蛋白表达的影响HBL提取液和DDP处理SPA1细胞48h后，免疫组化检测结果显示，与正常对照组相比，HBL各浓度组aspase3蛋白表达显著增高P0.01，Survivin蛋白表达显著下降P0.01。见表1。3讨论中药成分复杂，特别是中药复方成分更为复杂，其作用多环节，多靶点且量-效关系难以控制，绝大多数中药的作用机理不清成为制

14、约中药现代化的关键问题，也是限制中药走向世界的一个重要因素。本实验利用分子生物学技术对中药复方HBL的分子机理进展讨论。免疫组化检测结果显示，HBL各浓度组aspase3蛋白表达显著增高，Survivin蛋白表达显著下降，且呈一定的剂量依赖性；RT-PR检测结果显示，随着HBL浓度的增加，aspase3RNA表达上调，而survivinRNA表达下调。提示中药复方HBL对人肺癌SPA1细胞凋亡相关基因aspase-3和survivin表达具有明显调控作用。aspase家族是Fas/Ap1介导的凋亡信号转导途径的关键效应分子，通过靠近天冬氨酸残基的切割效应，使得aspase家族成员以类似于酶原激

15、活的方式互相激活，并形成级联放大效应，而aspase3是位于级联下游操纵底物酶切的重要效应因子，它是目前与凋亡关系最亲密的aspase家族成员之一。aspase3通过激活DNase、酶切多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶plyADPribseplyerase,PARP片段化、降解细胞骨架蛋白及一些癌蛋白等机制，使细胞赖以生存的关键物质不可逆性地破坏，最终导致细胞凋亡3。此外，由于aspase3是多种凋亡途径共同作用的因子，其蛋白表达程度的上下决定着细胞凋亡程度。Tranen等4研究了非小细胞肺癌aspase3、aspase6和aspase8的表达和凋亡，发现aspase高表达和肿瘤亲密相关，并反映肿瘤细

16、胞正向凋亡开展。本实验结果提示，HBL高表达和肿瘤亲密相关，并反映肿瘤细胞正凋亡开展。本实验结果提示，HBL提取液能显著进步人肺癌SPA1细胞apase3RNA和蛋白的表达，参与HBL提取液诱导SPA1细胞凋亡。Survivin蛋白在肿瘤凋亡调控过程中的作用越来越引起人们的重视，并被认为是肿瘤治疗的一个新靶点。IAP是抑制细胞凋亡的重要成分，这一蛋白家族抑制细胞凋亡的作用远远大于Blz家族的作用，Survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子5。许多研究说明Survivin不同于Bl2家族和其它IAP家族，其表达TNF/NFKB肿瘤坏死因子/核转录因子B信号转导途径的调控，可能与JAKSTAT途

17、径有关6。Survivin抗凋亡作用已被研究证实，它不仅通过阻断线粒体细胞色素释放，与下游凋亡效应因子aspase3和aspase7结合而对其活性产生直接抑制效应，还通过与纺缍体纤维的结合，间接抑制aspase对纺缍体的水解作用，有利于保护有丝分裂细胞的完好性，从而抑制细胞凋亡7。另外，Survivin与细胞周期素/细胞周期素依赖性激酶4ylin-dependentkinase4,DK4形成SurvivinDK4复合体，释放出P21，而P21能进一步与线粒体aspase3结合，抑制其活性，阻止细胞凋亡8。本实验结果提示，HBL提取液通过抑制人肺癌SPA1细胞SurvivinRNA和蛋白的表达，

18、使原先受到survivin抑制aspase3和aspase7蛋白酶原活化，进而激活下游的级联蛋白，从而诱导细胞凋亡，但由于细胞凋亡是一个多系统、多阶段参与的复杂网络过程，HBL诱导SPA1细胞凋亡确实切机理有待进一步研究。参考文献：1涂硕，韦星，万福生，等.花边莲提取液对人肺癌SPA1细胞增殖和凋亡的影响J.江西医学院学报，2022，455：24.2Abrsinig,G,Adida,AltieriD,etal.Anvelanti-apptsisgene,Survivin,expressedinanerandlyphalJ.Nated,1997,3(8)：917.3Enari,SakahiraH,YkyaaH