pcr原理与实验方法

1、PCR 定义PCR （Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合 酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延 伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离 克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。PCR 技术的基本原理PCR反应成分：1模板DNA； 2引物；3四种脱氧核糖核苷酸；4.DNA聚合酶；5反应缓冲液、Mg2等。PCR反应基本步骤：1变性：高温使双链DNA解离形成单链（94C, 30s）。2退火：低温

2、下，引物与模板DNA互补区结合（55C，30s）。3延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70 72C，3060s）变性（denaturation）：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链 分开而成单链的过程。2退火（annealling）：当温度降低时，弓I物与模板DNA中互补区域结合成 杂交分子。3延伸（extension）：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2存在下，DNA聚合 酶催化引物按53方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板， 经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。P

3、CR 反应的成分和作用总体积：一般为25川100 pl（一）无Mg2 buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH 值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过 50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。（二）Mg2 :终浓度为 1.52.0mmol/L，其对应 dNTP 为 200 pmol/L， 注意Mg2与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2，当 dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。Mg2能影响反应的特 异性和产率。（三）BSA： 一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作

4、用， 对 Taq 酶有保护作用。（四）底物（dNTPs）： dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH 值至7.07.5, 般存储浓度为10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应 终浓度为20200pmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实 验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。（五）Taq酶：能耐95C高温而不失活，其最适pH值为8.38.5，最适 温度为7580C，一般用72C。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补 原则为基础，按5J3方向逐个将dNTP分子连接到引物的3端，合成一条 与模板DNA互补的新的DNA子链。无35的外切酶活性，没有校正功能。 某种dN

5、TP或Mg2浓度过高，会增加其错配率。用量一般为0.55个单位 /100川。（六）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR 反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、 能与DNA结合的蛋白质。模板 DNA 的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释 模板。（七）引物：引物浓度一般为0.105pmol/L,浓度过高会引起错配和非 特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般1530个碱 基，引物过长或过短都会降低特异性。其3末端一定要与模板DNA配对， 末位碱基最好选用A、C、G （因T错配也能引发链的延伸）。引物G C

6、约占4555%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌吟堆积，两 引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。PCR 反应条件的选择（影响因素）温度参数：1变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94C（或95C ）变 性310min,接着94C变性3060s。2退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5C。引物长度在1525bp可 通过公Tm = （G C）x4C （A T）x2C计算退火温度，一般退火温度在4060C 之间，时间为3045s。如果（G C）低于50%，退火温度应低于55C。较高 的退火温度可提高反应的特异性。3.延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般

7、在7075C。延伸时 间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb 以内的片段1min是够用的。循环数：PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般2030次循环数较合适，过多 的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。PCR 产物积累规律：反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚 合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产 物竟争有关。PCR 常见问题没有扩增产物循环温度：变性温度、退火温度引物设计DNA聚合酶活性抑制性成份（蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合 酶活性的成份）5、DNA 样品非特异产物及电泳呈涂布状 1.Mg2 浓度调整引物、模板、聚合酶的用量适当减少循环数适当提高退火温度，缩短退火或延伸时间引物二聚体的形成检查引物的序列提高退火温度调整引物与模板浓度增加引物长度假阳性结果的预防1、实验器材应一次性使用（吸咀、PCR管）2、注意