细胞色素C的制备测定及SDS

1、细胞色素C的制备测定及SDSPAGE纯度鉴定摘要：本文研究细胞色素C的制备及测定方法和SDS测定蛋白质分子质量 及纯度鉴定，以猪心未原料，采用离心、透析、抽提、抽滤、沉淀等技术，制备 出细胞色素C，然后用消光法，紫外吸收法测得细胞色素C的产量，蛋白质的总 含量。再运用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定细胞色素C的分子质量。实验 结果细胞色素C的产量为8.84mg，产率为60.86mg/kg,蛋白质浓度为0.722mg/ml, 纯度为38.04%，细胞色素C的分子质量为12417，相对误差为0.14%。关键词：细胞色素C离心抽提抽滤透析消光法紫外吸收法SDS-聚 丙烯酰胺凝胶电泳法纯度前言：细胞

2、色素C是一种细胞色素C（Cytochrome C）是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶，是呼 吸链中的一个基本成分，广泛存在于所有的需氧组织中。一般说来，组织的细胞色素C的含量 与它们的呼吸活性大致成平行关系，在心肌与其它作剧烈运动的肌肉中含量最为丰富。在细 胞内细胞色素C位于线粒体的蛋白质一脂质络合物中，是线粒体电子传递链中重要成员，在 生物氧化过程中起着重要作用。细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂，早期研究发现在临床上 细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧状态，在使用细胞色素C后就可以纠正其物质的代谢，使细 胞恢复正常呼吸，病情得到缓解或痊愈目前在临床上虽非特效药物，但可用于缺氧急救、解 毒及其辅助治疗，是治

3、疗组织缺氧及由缺氧所引起的一系列症状的重要生物药品。本实验以 猪心为原料，向心肌中加入三氯乙酸溶液中，一起进行匀浆，大部分的蛋白质都沉淀下来， 细胞色素C则存留在三氯乙酸溶液中。将硫酸氨粉末加入到三氯乙酸抽提液中，硫酸铵与抽 提液中的肌红蛋白，血红蛋白等一起沉淀下来，细胞色素C则仍留于溶液中。进一步用三氯 乙酸酸化此溶液，细胞色素C就沉淀出来，然后透析并鉴定之。鉴定及测定细胞色素C用消 光法。在550毫微米波长下，细胞色素C的克分子消光值为:氧化型细胞色素C：K1=0.9*10”4/ 克分子/厘米，还原型细胞色素C： K2=2.77*104/克分子/厘米，样品较纯时，从氧化型转 变为还原型或者

4、还原型转变为氧化型，消光值的情况相同。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝 胶中加入了离子去污剂和强还原剂，使SDS蛋白质络合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分 子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子 质量的大小。当蛋白质的分子质量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈 线性关系。正文：材料与方法1.1原料：农贸市场购买的猪心1.2仪器：PHILIPS组织捣碎机SHZ-D （III）循环式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司） LXJ-IIB离心机（上海安亭科学仪器制造厂） 透析袋MD44V-2100紫外分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司）7

5、21分光光度计（上海第二仪器制造厂）JB-3型定时恒温磁力搅拌器（上海雷磁新泾仪器有限公司）DYY-11型 电泳仪（北京市六一仪器厂） 微量进样量25 ul （上海注射三厂）TY80A /S脱色摇床（金坛市江南仪器厂）或ZD-9556水平摇床（太仓市科 技器材厂）移液枪5-50 ul，移液枪20-200 ul1.3试剂：硫酸铵粉末，10%氢氧化钠溶液，0.145mol/L三氯乙酸溶液，0.1mol/L pH 7.4 磷酸钠缓冲液，铁氰化钾溶液，饱和的连二亚硫酸钠溶液，丙烯酰胺储存液（A液），分离 胶缓冲液（B液），堆积胶缓冲液（C液），10%过硫酸铵，TEMED，染色液，脱色液 1.4方法：细

6、胞色素C的制备取猪心一个，易U除脂肪，称量，绞碎，加入1： 1量的0.145mol/L的三氯乙酸溶液搅匀。将 此混合抽提物于室温下放置3小时，然后用细布过滤。用10%氢氧化钠溶液将上述混合液调 到pH 7.3,测量并记录此抽提液的体积，再于搅拌下慢慢地加入硫酸铵粉末（加入量按500 克/升混合液计算）用布氏漏斗抽滤，除去沉淀，收集粉红色滤液。测量并记录此滤液的体 积，搅拌下再加入硫酸铵粉末，（加入量按50克/升滤液计算）。此盐析液于冰箱中放置过夜。 上述盐析液经放置后出现少量沉淀，用布氏漏斗抽滤（双层滤纸），除去沉淀，保留上清液， 向上清液中加入20%三氯乙酸溶液（加入量按25克/升上清液计算

7、），以沉淀细胞色素C。迅 速地从3500转/分条件下离心10分钟，收集细胞色素C沉淀，再将这个砖红色的沉淀悬浮 于饱和硫酸铵溶液中（饱和硫酸铵的体积按150毫升/公斤心肌组织计算，可根据实验操作 情况减少30-50%）。将此悬浮液移于透析袋中，对水透析4-5小时，离心（3500转/分，10 分钟）除去少量暗黄色沉淀，记录此溶液的体积。测定细胞色素C的产量，纯度及产率氧化型样品的消光值E1：按下表加入试剂及样品，于550毫微米波长下测出氧化型样品的 消光值。试剂样品（毫升）空白（毫升）0.1mol/L pH 7.4磷酸钠缓冲液3.85.8适当稀释的细胞色素C溶液2.00铁氤化钾溶液0.20.2还

8、原型样品的消光值E1 :按下表加入试剂及样品，于550毫微米波长下测出还原型样品的消光值。试剂样品（毫升）空白（毫升）0.1mol/L pH 7.4磷酸钠缓冲液3.85.8适当稀释的细胞色素C溶液2.00饱和的连二亚硫酸钠溶液0.20.2测定体积为6毫升，细胞色素C的体积为V，则细胞色素C氧化型及还原型的产量分别为：Y1 （毫克）=E1/K1*M*6*V*稀 释倍数Y2 （毫克）=E2/K2*M*6*V*稀释倍数细胞色素C的分子质量M为12400。如果产品较纯Y1与Y2应当相等。由以上结果可以算出 产率：产率=产量（毫克）/心肌重量（公斤）用紫外吸收法测定细胞色素C溶液的总蛋白含量，可与消光法

9、测出的数据进行核对比较，求 出其样品的最终浓度：纯度%=消光法测出的产率（毫克）/蛋白含量测定的总蛋白含量（毫克）测定产品的分光光度吸收值测定细胞色素C溶液的光吸收峰。将操作2中的氧化型及还原型溶液取来测定可见光不同波长下的吸收值，绘出吸收曲线（波长-光密度值）。氧化型的最大吸收峰应在408毫微米， 530毫微米。还原型的最大吸收峰应在415毫微米，520毫微米及550毫微米。灌制分离胶将电泳仪上的玻板洗净，夹好，然后配制分离胶，加入试剂如下：A 液：5.6ml, B 液：3.0ml,蒸馏水：3.4 ml, 10%过硫酸铵：0.1ml, TEMED： 0.01ml 混合后，加入制胶室中，缓慢加

10、蒸馏水压平，聚合约10分钟。灌制堆积胶A 液：0.67ml，C 液:1.0ml, 蒸馏水：2.3 ml, 10%过硫酸铵：0.03ml, TEMED： 0.005ml 加入制胶室中，加上梳子，聚合后拔出梳子，用缓冲液赶走气泡，加标准样品12-15微升左 右，加样20微升，加好电泳缓冲液。电泳调电压150，电泳到指示剂到底部即完成。染色剥胶后用染色液染色15分钟，再用脱色液脱色2小时即可看见条带。拍照，量距离，测定分子量。成分分子质量分子质量对数值迁移率牛血清白蛋白662004.8210.158879兔肌动蛋白430004.6330.261682牛碳酸酎酶310004.4910.404984胰蛋

11、白酶抑制剂201004.3030.571651鸡蛋清溶菌酶144004.1580.705607多肽62003.7920.844237注：分离胶全长为：6.42cm由以上数据，Rf二分离胶开始至条带距离/分离胶全长，得图32结果与讨论：2.1测定细胞色素C产量的结果/nm还原型（空白）还原型样品氧化型（空白）氧化型样品55000.13200.090氧化型产量：Y1 （毫克）=E1/K1*M *3*V毫升*稀释倍数 wt=0.090/ （0.9*10000） *12400*30*3*1 =11.16毫克还原型产量：Y2 （毫克）=E2/K2* Mwt *3*V毫升*稀释倍数 =0.132/ （2.

12、77*10000） *12400*30*3*1 =5.32毫克产量=（Y1+Y2）/2=（11.16+5.32）/2 毫克=8.24 毫克产率=产量（毫克）/心肌重量（公斤）=8.24/0.1354=60.86mg/kg波长（nm）光密度值A2600.9642800.990蛋白质浓度=1.45A280-0.74A260=0.722mg/ml总蛋白量=0.722*30=21.66mg纯度%=消光法产量/蛋白质含量测定的总蛋白量=8.24/21.66=38.04%2.2由图1，2可知，还原型样品的最大吸收峰在415毫微米，520毫微米，550毫微米。氧 化型样品的最大吸收峰在410毫微米，530毫微米2.3拍摄的分离胶照片见下图根据图3中，y = -1.3681x + 5.0383, x为实验所测分离胶细胞色素C样品的迁移率， Rf=4.43/6.42=0.69，代入得 logMt=4.094,Mt=124172.4结论实验所提取的细胞色素C样品的蛋白质浓度为0.722mg/ml，纯度是38.04%，产率为 60.86mg/kg。还原型细胞色素C样品的最大吸收峰在415毫微米，520毫微米，550毫微米。氧化 型样品的最大吸收峰在410毫微米，530毫微米.与文献报道基本相符.用SDSPAGE鉴定测定细胞色素C得分子量为12417,而文献中细胞