免疫学技术和临床课件

1、免疫学技术和临床美国贝克曼库尔特公司免疫产品市场部洪军 2007.4 安徽内容摘要什么是免疫分析的表现免疫分析的基本概念如何去设计一个免疫分析试剂免疫分析对临床意义的改变Access2 介绍什么是免疫分析的表现免疫检测的分析表现准确性精密度灵敏度特异性检测线性范围试剂稳定性定标周期开瓶效期免疫分析检测的临床表现临床灵敏度和特异性是分析结果准确性的临床表现:理想状态健康人群疾病人群灵敏度 100%特异性 60%特异性 100%灵敏度 50%灵敏度增加 特异性增加假阴性 假阳性Cut-off设置cutoff值在此处用于筛查分析设置cutoff值在此处减少错误诊断带来的高花费设置cutoff值在此处

2、为了最少化错误结果分析表现特点: 正常人群参考值和10%CV（功能灵敏度）免疫分析的基本概念免疫学测定的中心问题作为免疫反应，抗原抗体的选择是整个免疫分析特异性和总体表现的关键如何选择好一个抗体去检测一个被检物质，而不与非常相似结构的其它物质有交叉反应，或漏掉须反应的物质，这是分析设计的重中之重抗体的量必须恰当，过多会引起复合物的溶解关于抗体的亲合力抗体除了要求纯度外（单价特异性）还必须要求亲合力，效价指抗体的量，亲合力指抗体的质在非竞争免疫反应的模式中抗体亲和力比标记物的最低检测极限更能影响分析的灵敏度在竞争法免疫反应的模式中抗体亲和力直接关系到竞争的结果对于样品中的干扰物质,亲合力影响分析

3、的抗干扰的能力免疫分析的工作定义免疫分析(Immunoassay) 是一种测试方式,使用特殊的抗体与被检测物质的结合,此被检测物质不能通过简单的化学方法所容易检测到的.通常在检测系统中会使用到一种叫标记物（labeling）的物质,常标记在抗体上通常会有一个分离（separation）的过程在最后读取信号前总是需要去仔细关注一下分析的模式（format） 检测技术免疫分析检测技术(Detection) 有许多可用的方法 应用一些 “标记物” 所产生的一些能量进行测定标记物可以或可以不被激活而产生能量通过一些相应的检测器对标记物产生的能量进行测定分离技术 分析模式 放射免疫分析(Radioimm

4、unoassay)优势优秀的灵敏度较宽的检测线性范围局限性标记物的半衰期短试剂效期短检测结果的重现性差每次检测都要做标准曲线分析的反应时间长，半天2天发射性污染有害很难实现自动化检测酶-颜色的变化酶(Enzymes) - EIA原理在免疫分析结束后通过催化所加入的酶底物典型的催化反应包括颜色的变化,用分光光度计进行检测优势非常容易使用的技术用于一些定性的分析局限性对定量分析所要求的灵敏度和宽线性难以实现ELISA技术必须每次定标试剂部分成分要复溶重组反应时间较长化学发光化学发光物质 - CLEIA原理不稳定的分子通过加入一些化学基团变得很稳定,而移去这些起稳定作用的化学基团后,分子结构变得不稳

5、定发出光（pH的改变，酶切作用，电激发等）优势 具备RIA所拥有的优势(灵敏度和宽线性),但排除其缺点用一个简单的光度计读数非常低的背景干扰类型 闪烁(flash), 持续(glow) 发光发光物质的稳定性水溶液中的稳定性化学发光物质AMPPD, Dioxetane (Lumi-Phos 530TM)-最稳定的化学发光物质（第三代）第一代：鲁米那第二代：丫啶酯类，三联吡啶钌代表性分析系统贝克曼库尔特 - Access/Access 2 /DxI800终点读数, 更稳定RLU00 5 10 时间(分钟)55 60 ACCESS化学发光标记物的特点很宽的检测线性范围可检测到6个数量级(例如: 1

6、- 100,000 units)极高的灵敏度可检测到小到10-21 摩尔/升很底的背景干扰对于一些超敏分析项目,有相当接近零值的背景信号更超强的试剂稳定性试剂效期开瓶效期定标周期分离技术免疫分析检测技术分离技术(Separation) 有很多方式典型的是,特异性结合的分析物被保留而未结合物质和无用的反应物被清除 分析模式 技术的创新微粒子包被珠包被微孔包被管包被分析模式免疫分析检测技术分离技术 分析模式- 有很多种方式可定义为分析的 “处方”设定一个最优化的模式(可变量)去最优化项目的临床应用 分析模式可变量夹心法(Sandwich) vs.竞争法(competitive)标记物的放置同步(S

7、imultaneous) vs. 分步(sequential)试剂/样品加入的顺序孵育的次数(步骤)清洗分离的次数(步骤)试剂/样品的体积/浓度孵育的时间孵育的温度夹心法分析模式捕捉抗体(Capture antibody)和标记抗体(labeled antibody)每个不同的抗体可以针对不同的抗原决定簇，或二个在同一个抗原决定簇分析更特异因为二个抗体同时反应适合于检测大分子物质bhCG TSHIgEProlactinFSH LH FerritinHBsAg竞争法分析模式只有捕捉抗体主要针对小分子物质检测 没有足够表面积的分析物去符合 “夹心法” 要求T3FT3 B12 Digoxin Pro

8、gesteroneT4 FT4 Folate Cortisol Estradiol如何去设计一个免疫分析试剂一个免疫分析项目的诞生里程碑(Milestones)市场调研确定需求项目的详细特点要求确定分析模式研发和优化证明分析表现符合项目的详细特点要求 (beta sites, clinical studies)提交注册项目临床应用的要求临床应用(claims)筛查（Screening）检测（Detection）诊断（Diagnosis）分层（Staging）预后（Prognosis）监测（Monitoring）项目的临床应用与分析表现必须到达的分析表现特征灵敏度（Sensitivity）特异性

9、（Specificity）精密度（Precision）线性范围（Dynamic range）其它分析模式的选择需考虑的因素分析物的特征体积（竞争法还是夹心法）浓度（一步法，二步法，反应时间等）潜在的“钩状效应”（hook effect）- 假阴性解决的方法可以使用2步法模式样品量和试剂量的平衡抗干扰能力仪器的能力局限性预处理的要求试剂原材料的选择原材料抗体标准品封闭试剂（稀释液）清洗缓冲液YYYYY抗体的选择单克隆(Monoclonal) 和多克隆( polyclonal)选择的标准(criteria)特异性(Specificity)灵敏度(Sensitivity)供应能力(Supply)相关

10、性(Correlation)可制造性(Manufacturability)花费(Cost)多克隆抗体(Polyclonal Antibodies)免疫动物获得,如羊或兔 时间长,复杂的制作流程注射,监测滴度(可能反复注射)周期性的抽血获得特征化(Characterization)和纯化(purification)生产出”鸡尾酒”式的抗体,针对所有抗原决定簇适合对临床灵敏度要求较高分析测试YYYYYYYYYYYYYYYYYYYY单克隆抗体(Monoclonal antibodies)YYYYYYYYYYYYY克隆的结果抗体的产生具有高度的同源性和特异性并针对一个抗原决定簇可以选择最好的抗体在大量

11、生产时可以确保持续的供应适合对临床特异性和批间一致性要求较高的分析测试抗体的选择筛选抗体需经过灵敏度，特异性和稳定性的评价许多的抗原决定簇并非一种分子所独有被测抗原的稳定性不同被测抗原的游离和结合模式案例: hLH 抗原位点图BetaAlphaB-D 1hTSHhCGB-D 2hCGA-D 1hCGhFSHhTSHB-D 3A-D 3A-D 2hCGhFSHhTSH案例: Troponin-I 抗原位点图肌钙蛋白 - I稳定性的问题氧化的问题磷酸化的问题N-terminalC-terminal010203040506070809010011012013014015016017018019020

12、0POO_ _Access 1st Gen31-3458-70 (cross-react)157-160PMP Detect Access AccuTnI _24-4041-49PMPDetect抗体的选择等分子(Equimolar) vs. 非等分子(non-equimolar)分析依赖于特异性抗体的选择结合模式-一些位点被隐藏游离模式-所有位点都暴露PSAACTPSA嗜异性抗体(Heterophile Antibody)病人样品中可能自然产生一些针对动物免疫球蛋白的抗体(通常是鼠或羊)来源于暴露于这些动物或接受过动物血清的治疗分析的干扰可以在双单克隆夹心法分析模式中引起假阳性可以在单克隆/

13、多克隆分析模式中出现假阴性嗜异性抗体反应假阳性 较多见嗜异性抗体在捕捉抗体和检测抗体中搭桥,出现在双单克隆夹心法模式中嗜异性抗体反应假阴性 较少见嗜异性抗体争夺捕捉或检测抗体的抗原结合位点,出现在单克隆/多克隆分析模式中稀释液封闭剂（稀释液）可以加在反应基质中或整合在试剂盒内动物蛋白（鼠，兔，羊等）各个厂家生产的分析试剂都有可能会不同程度的受到任何一个病人血清的影响！定标程序厂家产生的主定标曲线感觉节省的校正型 2 点定标会增加定标的频率对非线性的标准曲线可能会有问题(大多数的免疫分析产生的是非线性的标准曲线)多点定标曲线定量 典型的是6个水平, 定性 典型的是2个水平可以达到最大的灵敏度,准

14、确性和精密度可以有更长的定标周期间隔标准品 参比物参比物纯化蛋白(Purified protein)通常制作较便宜相对较短的稳定时间,需特殊的存放条件一般需要冻干保存可能会有批间的不一致性重组(Recombinant)相对昂贵很长的研发时间更稳定和可靠可以以液体的模式供应分析清洗液清洗液使用的类型和量，在清洗步骤结束后分析物提供的有效保留方式的能力和清洗残留的有效去除能力等，都会影响到分析表现清洗液中加入适当的表面活性剂可以去除不需要的生物活性物质 (干扰物质)免疫反应中不能用水进行分析内的清洗分离!试剂的优化需优化参数时间程序步骤各类试剂浓度pH/离子强度需优化的内容扩散的速率结合的速率复合

15、物的稳定性优化后达到的表现灵敏度(Sensitivity)精密度(Precision)线性范围(Dynamic range)准确性(Accuracy)相关性(Correlation)试验设计选择对临床检测结果的影响临床试验结果反映了试验过程中各种条件的优化免疫分析设计及优化开发免疫分析试剂盒的过程就是选择并优化各种实验条件，达到预期结果并能准确反应临床真实情况的过程抗原/抗体分析模式分离技术检测技术总体分析表现Beckman Access AccuTn-I符合NABC/IFCC/ESC/ACC的导则要求最好的99%分位值的比值没有嗜异性抗体,HAMA和RF的干扰对样品没有抗凝剂（肝素）的要求周转时间(TAT)小于30分钟(12分钟)最宽的检测线性范围最长的定标稳定时间最多的临床应用诊断危险分层（高灵敏度和精密度）治疗监测为什么贝克曼有如此好的结果表现呢？心肌钙蛋白和心脏疾病cTnI的水平已用于AMI的诊断, 但随着诊断检测技术的提高cTnI可对病人的短期和长期的心血管事件的风险进行预期免疫分析的未来过去症状的处理没有标准的准则现在标准化的诊断和治疗的步骤减少操作的可变性 和不依从性着重单个个体明天人群疾病的花费和因果关系确认一些医学措施所带来的益处风险评估教育项目预防发病率展望控制发病率(控制你因某病而死亡)紧急监护疾病管理人群健康管理更有效合理的管理疾病的