色谱联用技术课件

1、Finding Whoa at Office 2.01色谱联用技术第9章滨州医学院 药学院赵 峰色谱的定性分析气相色谱-质谱联用技术气相色谱-傅里叶红外光谱联用技术液相色谱-质谱联用技术液相色谱-傅里叶变换红外光谱联用技术气相色谱-质谱联用技术关键技术问题仪器接口 除去色谱柱后流出物的载气，保留组分协调色谱仪和质谱仪之间的压力和流量(抽真空)质谱扫描速度满足气相色谱出峰速度快基本原理磁聚焦质谱四级杆质谱飞行时间质谱磁聚焦质谱如果在离子源被电离的样品分子质量为m，电荷为 z (e)，(S1)加速电压为V，（电场作用能量为：zV；则离子被加速的速度为v，获得动能为：1/2mv2。 1/2mv2 =

2、 zV (1)受到磁场（磁场强度B）中磁力的作用，沿磁场曲线半径R的轨道发生偏转，在做曲线运动时，此离子受到离心力作用，即mv2/R。同时，该力与磁力（向心力）zvB 达到相当时，此离子才能通过磁场，进入检测系统被记录。 mv2/R = zvB (2)发展最快：毛细管气相色谱与四极杆台式质谱联用结构简单、体积小、扫描速度快、灵敏度和分辨率相对小，但能满足一般实验室要求通过加在四极杆上的交变电压，改变电压和频率进行扫描。从而允许一定质量（速度）的离子通过四极场到达接受器（是电场扫描）。四极杆台式质谱通过加在四极杆上的交变电压，改变电压和频率进行扫描。从而允许一定质量（速度）的离子通过四极场到达接

3、受器（是电场扫描）。 m/z = 2E/v2 其中：E=电压（离子动能），v = 离子速度 四极（型）质谱优点扫描速度快，价格便宜，体积小，目前已开发出台式仪器被广泛使用。质量范围窄，分辨率有限（目前，还不能测定高分辨）缺点利用相同能量的带电离子，由于质量的差异而具有不同速度的原理，实现不同质量的离子以不同时间通过相同的漂移距离（领域）到达接受器。飞行时间质谱利用相同能量的带电离子，由于质量的差异而具有不同速度的原理，实现不同质量的离子以不同时间通过相同的漂移距离（领域）到达接受器。 m/z =2E/v2, v =d/t 代入左式得到 m/z =Kt2 (k =2E/d2) (d：飞行距离；t

4、：飞行时间 )飞行时间质谱仪优点扫描速度快，灵敏度高，质量范围宽，结构简单，造价低廉等 缺点分辨率相对低。但是，现在已经提高到10000以上分辨率 质谱分析的主要电离技术及其应用范围： EI-MS: 高挥发性、一般分子量1,000 Da的化合物CI-MS: 高挥发性、一般分子量1,000 Da的化合物FAB-MS: 热不稳定、难挥发性、中等极性，分子量 3,000 Da的化合物ESI-MS: 热不稳定、中至高极性，可检测到数十万Da分子量 的化合物，混合物，此外（包括APCI-MS，相对弱极性分子）真正实现了LC-MS技术。MALDI-(Tof)MS : 主要用于蛋白质等生物大分子的测定（可检

5、测到近百万Da分子量 ）。EICIFABESIMALDI电子轰击电离方法（EI）是通过具有一定能量的（轰击）电子直接作用于被气化的样品分子，使其电离的离子化技术；分别实现样品的气化与离子化的典型方法，也是应用最长久的经典方式。由于首先对被测样品在进样系统中的玻璃管或金属管中加热气化，同时在一定能量的电子轰击下实现电离，因此EI技术属于硬电离方法。EI法（Electron Impact Ionization）M + e - M z+ + (z+1)e - (z1) (1)M + e - M- (2)技术成熟，离子源结构简单 ；峰重现性好，具有标准数据及图谱库、 适用于检索； 离子化效率高，碎片离

6、子多，提供一定的结构信息缺点（应用范围比较窄） 不适合极性大、热不稳定性化合物；分子量有限，一般1,000 Da。CI法亦是一种样品的汽化与离子化分别实施的电离法典型它也不适合对易热分解的化合物，但是，因为要利用离子分子反应来实现离子化，因此是软电离法。是其它软电离法，如FAB、MALDI、APCI、TSP等的基础，同时是气相离子化学的主要技术。在CI离子源中，首先用电子轰击导入的反应气体，使其离子化。化学电离法（CI, Chemical Ionization） 概念 快原子轰击电离法是，用高速原子（离子）枪射 出的数kV的高速中性原子束（Ar, Xe or Cs+离子）对溶解在底物中的样品溶

7、液进行轰击，产生 M+H+ or M+等离子的电离法。 FAB法的关键是选择适当的（基质）底物， 从而,可以进行从低极性到较高极性的范围较广的有机化合物测定，是目前应用比较广的电离技术。快原子轰击法(FAB,Fast Atom Bombardment) 产生的分子离子一般，常见的M+H+离子根据底物脱氢以及分解反应产生的M-H+容易提供电子的芳烃化合物产生M+甾类化合物、氨基霉素等还产生M+NH4+糖甙、聚醚等一般可（产生）观察到M+Na+大气压电离技术（atmospheric pressure ionization, API）顾名思义是一种常压电离技术，它不需要真空API技术包括电喷雾（ES

8、I）和大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization, APCI）两种离子化技术电喷雾离子化法（ESI，Electrospray Ionization）样品溶液由泵输送从毛细管流出的瞬间，在雾 化气（N2）、强电场（25kV）和近于大气压的干燥气体（N2）的作用下，溶液在毛细管端口发生喷雾，产生高电荷的液体微粒（液 滴），所以称之为电喷雾随着液滴中溶剂的挥发液滴逐渐缩小，当电荷间的斥力克服了液滴的内聚力时，发生“库仑爆炸”（Coulomic explosion）。较小的液滴继续蒸发，电场增强，离子向表面移动，表面的离子密度越来越大，最终导致离子

9、从表面蒸发，产生单电荷或多电荷离子它是（目前）最软的电离技术，通常只产生分子离子 峰， 因此可以测定不稳定的极性化合物，并可直接测定混合物。多电荷离子的形成，可以分析生物大分子，如蛋白质和寡核苷酸等。通过调节离子源参数（改变取样锥体电压），可以控制离子在离子源内的断裂，从而给出结构信息（源内CID）。主要特点FAB-MS谱ESI-MS谱基质辅助激光解吸离子化法MALDI（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization）试样溶解或悬浮于基质中，激光束辐射到基质和试样分子上。基质吸收激光束能量后汽化，部分试样分子伴随基质的汽化而解吸。基质吸收大部分激光能量，

10、减少了试样分子被激光能量破坏及过度电离成碎片离子。激光：固体氮激光，紫外光 波长： 337nm 功率：106108W/cm2 脉冲时间：10-610-9秒气质联用的条件柱条件1-2mL/min，最大5mL/min内径0.25-0.32mm扫描条件选定质量范围选择离子检测总离子流图质量碎片图气质联用给出的信息气质联用质谱谱库及检索简介电子轰击质谱70 eV检索标准电离条件按特定程序进行比较相似度由高到低列出化合物NISTNIST/EPA/NIHWiley库 农药库、药物库、挥发油库常用的质谱谱库：检索方式： 在线检索离线检索电子轰击离子源，70 eV谱库中的为纯物质 (本底扣除功能)选择合适的质

11、谱图相似度结合其他信息如基峰、分子离子峰及杂原子等用已知标准物质对照定性检索条件：气象色谱-傅里叶红外光谱联用傅里叶红外光谱仪光源Micheison干涉仪探测器计算机高分辨率波数精度高扫描速度快光谱范围宽灵敏度高FTIS的特点：色谱柱选择宽口径，厚液膜的涂璧开管柱柱前气化光管体积与色谱峰体积相匹配光管温度控制在200以下GC-FTIR的GC条件： 应用 复杂有机混合物定性、定量分析的有效手段 在环保、医药、化工、石油工业、食品、香料和生化等领域液相质谱联用技术LC-MS联用存在的技术难题压力匹配流量匹配气化问题LC-MS接口直接液体导入移动带式接口热喷雾接口粒子束接口电喷雾电离接口LC-MS分

12、析条件的选择：接口的选择正负离子模式的选择流动相的选择温度的选择液相色谱-傅里叶红外光谱联用多数化合物的红外光谱吸收较弱，要求样品量大HPLC的流动相具有红外吸收流动池接口： 平板式投射柱式投射流动池柱内ATR流动池第10章 液相色谱样品预处理色谱分析的全过程样品的采集取样点的选择和样品收集，样品的运输和储存样品的制备待测组分与干扰组分分离、转化成可分析形态色谱分析数据处理和结果的表达液相色谱的要求可溶解不会发或难挥发的样品过滤样品不适合直接分析含量低含有干扰基质, 粘滞流体、胶体溶液、固体混悬液： 滤过离心沉降液体： 固相萃取液液萃取稀释蒸发蒸馏微渗析冷冻干燥固体： 固液萃取索氏提取强制流动

13、浸出均匀化超声溶解加速溶剂萃取自动索氏提取超临界流体萃取微波辅助提取热提取在水中有较低的溶解度具有挥发性与HPLC检测技术相容具有极性并可形成氢键，以利于提高有机相中被测物的回收率纯度高，尽可能降低对样品的污染液液萃取中溶剂的选择：粒径40 m柱压低，塔板数少，分离效率低，一次性使用正相吸附剂硅酸镁，氨基、氰基、双醇基硅胶，氧化铝反相吸附剂键合相硅胶，芳环氰基离子交换吸附剂阳离子：苯磺酸，丙磺酸，丁磺酸阴离子：三甲基丙基胺，氨基，二乙基丙基胺固相萃取技术：SPE聚合二乙烯苯-N-乙烯吡咯烷酮亲水和亲酯免疫亲和吸附剂抗体-琼脂糖或硅胶分子印迹型吸附剂生物基质洗脱剂传质速率正相吸附剂：非极性有机溶剂反相吸附剂：极性有机溶剂离子：缓冲液固相萃取装置：SPE柱固相微萃取技术(solid phase mic