蛋白酶的盐析沉淀实验报告

1、文档编码 : CZ4M1Q5Z1S10 HT6E8A3Z8M8 ZZ2L7R5F6L9蛋白酶的盐析沉淀试验报告试验目的：班级：生工 1005 学号： 0203100520 姓名：朱同辉1.把握使蛋白质胶体溶液保持稳固的因素；2.明白蛋白质沉淀的几种方法及其意义；3.把握测定蛋白酶活力的原理和方法；4.学习酶活力的运算方法；试验原理：盐析法在蛋白质溶液中加入少量中性盐,蛋白质溶解度增加,称为盐溶；而加入大量中性盐达确定浓度,蛋白质就会沉淀,称为盐析；原理 ： 大量盐加入后,能与蛋白质争夺水分子,去除水膜；大量盐能中和蛋白质分子表面电荷,使分子间静电斥力减弱,疏水作用增强,使蛋白质沉淀；盐析成效：

2、二价离子 一价离子 离子半径大离子半径小阳离子 Mg2+Ca2+Ba2+NH4+Na+K+Pb+Cs+ 阴离子 PO43-SO42-Cl-Br-NO3-I-SCN- 蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用 Cohn 体会式来表示：log S K s I式中： S蛋白质的溶解度I离子强度 常数,与温度和 pH 有关I 1 c iz i 22 Ks盐析常数,与蛋白质和盐的种类有关 其中 I 依据下式运算：式中： cii 离子的浓度（ mol/L）蛋白酶活力的测定zii 离子所带的电荷福林（ Folin）试剂在碱性条件下可被酪氨酸仍原成兰色化合物,蛋白酶水解酪蛋白产生 酪氨酸,将产物中未被水解的酪

3、蛋白除去后与福林试剂作用,依据显兰色的深浅可以运算出酪氨酸的产生量,从而推断酶活力的大小；酶活力4KNO.D68010蛋白酶液的稀释、酶活测定和运算K在酪氨酸标准曲线上 O.D 值为 l 时酪氨酸的微克数（ g）,K 值为 108.53 N酶液稀释倍数 4酶反应液为 4 ml,取出 1 ml 测定,故乘以 4 10反应时间为 10 min 参考稀释倍数：原酶、饱和度20%,30%,40%,50%,60%,70%的上清液分别为 1000,200,150,100,100,100,50 倍 试验步骤：1）蛋白质盐析 分两个大组进行试验,每大组取 6 只烧杯编号, 分别加入 50 ml 蛋白酶液, 分

4、别称量 5.70,8.80,12.16,15.66,19.5 和 23.6 固体硫酸铵粉末（对应20%,30%,40%,50%,60%,70%饱和度）,在磁力搅拌器不断搅拌下,将其缓慢加入酶液中,加完后再搅拌 5 min ,使硫酸铵完全溶解；然后静置使蛋白酶沉淀完全；将含有沉淀的酶液当心倒入离心管中,在天平上称重平稳, 用高速冷冻离心机离心于 10,10,000 r/min离心 20 min；将上层清液倒入量筒记录其体积,并分别测定酶活（u/ml）,即为该酶的溶解度S；2）蛋白酶活力的测定：1.将 2%酪蛋白溶液 40预热 3-5min 2. 取 3 支试管编号 0、1、2,分别吸取待测酶液

5、1ml 放入试管中, 40水浴中预热 1-2min 3.往 0 号试管加入 0.4mol/L 三氯醋酸 2ml,再往 3 支试管中加入 2%酪蛋白 1ml ,计时摇匀, 40反应10min 4.往 1、2 号试管中加入 0.4mol/L 三氯醋酸 2ml,摇匀,取出 3 支试管静置 10min 5. 另取 3 支试管,分别吸取上述清液 1ml ,各加入 0.4mol/L 碳酸钠溶液 5ml,福林试剂 1ml,于 40水浴中保温 20min 显色；6.以 0 号管为对比,在波长 680nm 处测定 1、 2 号管的吸光度,求出平均值；3）蛋白酶液的稀释、酶活测定和运算运算出各种硫酸铵饱和度下的硫

6、酸铵浓度,离子强度,蛋白酶溶解度和上清液酶活残留,并填表；以 log S 为纵坐标, I 为横坐标作图,将直线部分线性回来,求出 析曲线；数据记录及试验结果：Ks 和 的数值,建立起蛋白酶的盐编号1 O.D 680平均值上清液体积 /mL 原酶液0.388 0.406 2 0.424 饱和度 20% 1 1.069 1.121 55.8 2 1.173 饱和度 30% 1 0.819 0.821 55.4 2 0.823 饱和度 40% 1 0.952 0.985 53.0 2 1.018 饱和度 50% 1 0.021 0.220 56.2 2 0.418 饱和度 60% 1 0.062 0

7、.051 58.5 2 0.040 饱和度 70% 1 0.091 0.151 62.1 2 0.211 编号NH4 2SO4 浓度 mol/L 离子强度I 上清液酶活蛋白酶溶解度S logS 原酶液0 0 饱和度 20% 0.82 2.46 4866 271522.8 5.43 饱和度 30% 1.23 3.69 7128 394891.2 5.59 饱和度 40% 1.64 4.92 6414 339942.0 5.53 饱和度 50% 2.05 6.15 955 53671.0 4.72 饱和度 60% 2.46 7.38 221 12928.5 4.11 饱和度 70% 2.87 8.61 328 20368.8 4.31 争辩：通过本次试验,初步把握了蛋白酶盐