核酸及其多糖的提取课件

1、核酸及其多糖的提取 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。 第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取及其常见问题、原因分析及其对策DNA提取的基本步骤 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中基因组DNA提取：材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细

2、胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集DNA提取的几种方法基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它基因组DNA CTAB法 CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巯基乙醇 终

3、浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。CTAB法流程图 植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液SDS法DNA提取缓冲液组份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH 8.0 ）NaCl SDS终浓度 10

4、 mM 20 mM 0.4M 2%SDS法流程图 （以动物组织为例）动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液 非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法线粒体、叶绿体 DNA的提取差速离心结合SDS裂解法质粒DNA的提取：材料准备使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）质粒DNA的提取：细胞裂解菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不

5、宜过长，否则会有基因组DNA的污染G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁质粒DNA提取碱裂解法煮沸法质粒DNA提取碱裂解法 碱裂解法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。质粒DNA煮沸法煮沸法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭

6、合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。核酸分离纯化 吸附材料结合法： 硅质材料 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值 洗脱。快捷 高效。 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用 于纯度要求高的实验 磁

7、珠 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从 而达到分离目的 核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法核酸分离、纯化 蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理核酸分离、纯化：多糖去除高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。

8、用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。多酚的去除 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 盐离子的去除：70的乙醇洗涤 核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期

9、储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解RNA提取的通用方法 异硫氰酸胍/苯酚法 原理： 1.细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 2.释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 3.有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 步骤：材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除

10、杂物。洗涤：70乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNARNA提取常见问题 RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳RNA降解 新鲜细胞或组织： 裂解液的质量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足 组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 冷冻样品： 样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70冰箱保存。样品要相对小一点； 先用液氮研磨，再加裂解液匀浆； 样品与

11、裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。多糖的提取 多糖是存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物，它是生物体除蛋白质和核酸以外的又一类重要的信息分子。 种类繁多的植物多糖，存在于植物中的部位不尽相同。而且， 一般植物细胞壁比较牢固，在提取前需进行专门的破细胞操作。植物多糖提取的研究中采用了许多不同的方法，包括溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声波强化法、微波法。1溶剂提取法 溶剂提取法首先要考虑的因素是选择溶剂，一般都应遵循相似相溶的原则，即极性强的有效成分选择极性强的溶剂，极性弱的有效成分选择极性弱的溶剂。多糖是极性大分子化合物应选

12、择水、醇等极性强的溶剂。一般植物多糖提取多数采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去不溶物；或利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质， 用高浓度乙醇沉淀提纯多糖。2酸提法 有些多糖适合用稀酸提取, 并且能得到更 高的提取率。 孟宪元等在茜草多糖提取研究中, 发现相对于水提, 以稀酸提取茜草多糖, 产品纯度较高。 具体方法如下: 茜草根粗粉1000g，5%HC1浸泡， 离心， 取上清液加入EtOH并调节至浓度为70% ，静置， 2500 rpm 离心，收集棕色沉淀物，95% EtOH 洗涤3 次，以4% HCl 溶解加1%活性炭脱色， 真空抽滤，滤液4过夜，弃去容器底部少许沉淀物，溶液置透析袋

13、内， 逆水法透析3日，冷冻干燥， 得白色粉末约10g (多糖A) 。3碱提法 采用稀碱提取: 多为0.1 1M 氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加硼氢化钠或硼氢化钾。 碱提优势也是因多糖类的不同而异。与酸提类似, 碱提中碱的浓度也应得到有效控制,因为有些多糖在碱性较强时会水解。 4酶提法在多糖的提取过程中, 使用酶可降低提取条件,在比较温和的条件中分解植物组织, 加速多糖的释放或提取。此外,使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等非目的物, 常用的酶有蛋白酶, 纤维素酶, 果胶酶等。周峙苗得到酶解法提取羊栖菜多糖的最佳实验参数为：加纤维素酶量为8% (酶/藻粉) ，果胶酶量为4% (酶/藻粉) ，pH3.4，酶解时间3h， 酶解温度为50。5超滤法超滤是一种膜分离技术，所采用的超滤膜能够从水和其