透射电镜的其他制样技术课件

1、第四章 透射电镜的其他制样技术冷冻超薄切片技术冷冻蚀刻技术负染色技术电镜酶细胞化学技术电镜免疫细胞化学技术电镜放射自显影技术电镜X射线微区分析制样技术第一节 冷冻超薄切片技术p172冷冻超薄切片技术是将组织从活体取下后，经过简单的固定或不固定就直接冷冻，并在冷冻的条件下进行超薄切片的技术。冰冻超薄切片流程固定（低浓度戊二醛，短时间固定）明胶“包埋”（明胶或甲基纤维素、醛交联的牛血清白蛋白，此步可省略）冷冻保护处理（甘油、蔗糖、二甲基亚砜）超低温快速冷冻（液氮直接冷冻，借助金属材料，使用制冷剂）冷冻切片（- 90 -105）染色（负染色，正染色，不染色）优 点 新鲜组织不经过任何化学处理或只经轻

2、微化学处理，组织的化学成分不发生改变、可溶性成分不被提取、酶不被破坏、抗体活性得到很好保存。适于细胞化学（酶、免疫）分析及X射线微区分析。技术关键是识别与下述因素有关的假象： 瞬时或完全解冻 冷冻干燥切片的偶然再水化 冰的移动再结晶造成可溶性元素重新分布 冷冻切片的污染第二节 冷冻蚀刻技术p178 冷冻蚀刻技术是冷冻断裂技术和复型技术相结合的一种样品制备技术，是通过冷冻后，将组织劈开，显示其不同劈裂面的细胞内超微结构，经加温使其结构表面的冰升华，然后用铂、碳喷镀得到复型膜，腐蚀掉组织后就留下其内部细微结构真实的自然形貌的复型膜。 在显示生物膜的结构以及细胞连接方面有着独特的作用。一、塑料一级复

3、型样品上滴浓度为1%的火棉胶醋酸戍酯溶液或醋酸纤维素丙酮溶液，溶液在样品表面展平，多余的用滤纸吸掉，溶剂蒸发后样品表面留下一层100nm左右的塑料薄膜。分辨率低（1020nm）电子束照射下易分解和破裂。a-样品及电子强度示意图b-0.3%C钢，600回火0.5h，6000塑料一级复型 a-投影 b-喷碳投影和喷碳示意图a-样品及电子强度示意图b-k-3镍基高温合金，扩散层中相，7000碳一级复型b- k-3镍基高温合金，扩散层中相，7000塑料-碳二级复型a-样品制备示意图二级复型照片（一）二级复型照片（二）复型薄膜ER 内质网 M 线粒体优点：大面积暴露膜的表面结构，一般超薄切片法难以达到标

4、本制作过程中，可以不受化学固定、脱水、包埋等的不利影响，能观察到更接近生活状态的细胞超微结构可以对细胞或细胞器断裂面作电镜的三维立体观察第三节 负染色技术p142又称为阴性反差染色。原理： 密度反差原理某样品如果被密度比自身大2倍以上的物体浸没时，电镜下就形成强反差像 异常反差原理由于静电场作用所形成的反差特点：提高了标本的反差和分辨率 简便易行，不要求高纯度的样品 染色本身不改变生物标本的活性负染色技术常用染液染液为重金属盐类，常用的有：1%3%的磷钨酸钾、磷钨酸钠（ pH6.47.0 ）0.1%1%的醋酸铀水溶液（ pH4.5）常用方法： 现将要观察的生物样品制成适当浓度的悬液（105/m

5、l），滴一滴在覆有Formvar膜或碳膜的铜网上，沉淀510min后用滤纸吸去多余液体。在铜网上液滴将干未干时将染色剂滴在铜网上，染色510min，滤纸吸干观察。避免标本凝集现象 生物标本凝集成团的原因：可能是由于标本表面张力、标本带电荷、支持膜的“疏水”作用及其制备的标本的质量、悬液的酸碱度等问题 解决办法：采用分散剂（BSA） 具体：在0.5ml样品内加入34滴0.005%0.05%牛血清白蛋白（BSA），或直接用0.01% BSA作为离心沉淀物的稀释剂甲型流感病毒，多形态性（园，椭圆，丝状体），外膜有放射状排列的纤突第四节 电镜酶细胞化学技术p103目前电镜下能定位的酶还不到100种，而

6、且只能作定性观察，即通过酶的活性间接证明酶的存在。原理：先将酶原位固定在细胞内，再使它与特定底物起反应，底物的分解物经过捕捉反应沉着于发生分解的原位上，最后使沉着物变为电镜下可以见到的物质。电镜下能定位的酶：水解酶、氧化酶、转移酶（应用少）1. 水解酶水解酶：磷酸酶类，酯酶类，芳香基硫酸酯酶，糖苷酶，作用于肽键的酶孵育液：酶的反应底物&捕捉剂（重金属类，如铅、铜、钡、铈等）反应基本原理：底物 初级反应产物 最终反应产物 酶 捕捉剂（多为不溶性金属沉淀物）2. 氧化酶氧化酶H2O2H2OnDABDAB锇黑（高电子密度）氧化聚合物OsO43. 脱氢酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸延胡索酸酶铁氰化物亚铁氰化物亚

7、铁氰化铜沉淀Cu2+酶细胞化学的常规操作取材 固定（低浓度的戊二醛）置换缓冲液（建立适宜的pH条件）孵育（新鲜配制的孵育液）漂洗组织（去除剩余试剂，特别是铅离子）后固定（1%四氧化锇）脱水包埋（同常规，脱水时间缩短）超薄切片与染色对照实验（去除特异性反应）酶及其在细胞内的定位部位酸性磷酸酶溶酶体，高尔基碱性磷酸酶细胞膜葡萄糖-6-磷酸酶内质网，核膜乙酰胆碱酯酶神经细胞的内质网，核膜，突出间隙琥珀酸脱氢酶线粒体内膜和嵴细胞色素氧化酶线粒体膜和嵴焦磷酸硫胺素酶高尔基体腺苷三磷酸酶分解ATP，耗能部位髓过氧化物酶粒细胞和单核细胞的内质网、核膜、高尔基体和胞质颗粒中血小板过氧化物酶巨黑包的内质网及血小

8、板致密管道系统第五节 电镜免疫细胞化学技术p110免疫电镜（immunoelectron microscopy,IEM）技术使利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量显示抗原的技术方法。为研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段分为：免疫凝集电镜技术，免疫电镜定位技术免疫电镜技术的三个发展阶段：1959年 铁蛋白标记技术1968年 酶标记技术1970s 胶体金标记技术1. 铁蛋白标记技术 铁蛋白分子质量大，电子密度高，适用于定位细胞膜表面抗原。2. 酶标记技术酶与抗体交联 优点： 可用于细胞内的定位 可现在光镜结果阳性部位定位后进一步电镜观

9、察缺点： 酶反应产物会发生一定程度的扩散，因此分辨率不高3. 胶体金标记技术 胶体金作为特异细胞成分的标记物可用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位，使目前应用最广的免疫电镜标记物。优 点：胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显变化金颗粒定位比酶反应物更精确胶体金标记物易于制备，可进行免疫电镜的双重或多重标记金颗粒能发射强烈的二次电子，使扫描电镜的理想标记物经过银显影增强后的金颗粒呈现黑（褐）色，能用于光镜观察能用于冷冻蚀刻标本的免疫标记 常用免疫电镜方法的原理及步骤PAP（peroxidase-antiperoxidase）法，又称可溶性酶-抗酶法。特点为参加反应的抗体都

10、不被酶直接标记。包括以下步骤：用一抗（Ab1）与组织中特异性抗原（Ag）相结合形成抗原抗体（AgAb1）复合物；用二抗（Ab2）的一个Fab段与一抗结合，另一个Fab段游离，形成抗原-一抗-二抗（Ag-Ab1-Ab2）复合物；用过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物（PAP，与Ab1同种动物的血清）与二抗的游离Fab段结合，形成Ag-Ab1-Ab2PAP复合物；用过氧化氢和二氨基联苯胺（DAB）使PAP的过氧化物酶形成不溶、暗棕色的嗜锇化合物。PAP（peroxidase-antiperoxidase）法优点： 保存抗体活性好；PAP复合物稳定；敏感性高，比间接免疫荧光抗体法敏感性高1001000倍；

11、节约抗体用量,也减少非特异性背景染色。缺点：反应产物颗粒较大，遮盖背景；DAB有致癌作用，操作中需小心；内源性氧化酶对此法有干扰。 ABC法 基本原理： 抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物技术（Avidin-Biotin-Peroxidase Complex Technique）简称 ABC技术，是目前常用的免疫细胞化学技术之一。1979年Guessdon首先把生物素-卵白素技术用于免疫组织化学，先后设计出桥式卵白素-生物素（BAB）技术和标记式卵白素一生物素（LAB）技术，1981年Hsu和许世明在BAB法和LAB法基础上改良而建立了ABC法， 其基本原理与PAP法相似，特点是利用抗生物素分

12、别连接生物素标记的二抗和生物素标记的过氧化物酶，形成抗原-一抗-生物素标记的二抗-抗生物素过氧化物酶复合体（AgAb1Ab2ABC）。抗生物素又称卵白素（Avidin），它有四个活动结合点，并与生物素有特别高的亲和力，一旦和生物素结合就极为稳定。当生物素和二抗共价偶联后，就使二抗获得与抗生物素相结合的能力。ABC法第六节 电镜放射自显影技术p143 放射自显影术(autoradiography,ARG)： 是使用感光材料（核乳胶、X胶片）与含有放射性核素标本接触，从而检测出放射性核素标记的探针、核苷酸等存在于靶基因、蛋白、细胞内的一种示踪定位技术。 放射性核素标本放射性同位素所发射的带点离子（通常用离子）原 理： 感光材料中的溴化银被带电粒子作用，释放出电子。 AgBr + Ag+Br + e- 该电子被正电荷的银离子俘获。 e- + Ag+ Ag 正电荷的银离子被还原，在溴化银分子中形成潜影 Ag Ag nAg 经显影、定影处理，在X胶