CCR9CCL25介导小鼠经生殖道hCGβ避孕疫苗粘膜免疫后B细胞

1、CCR9/CCL25介导小鼠经生殖道hCG避孕疫苗粘膜免疫后B细胞【关键词】hg粘膜免疫r9/l25b细胞归巢r9/l25engagedinbellhingaturinegenitaltratafteriunizatinviavaginaithlatbaillusexpressinghglabratryfrreprdutiveiunlgy，hspitalinstitutefbstetrisgynelgy，fudanuniversityshanghaiedialllege，shanghai200011，hinakeyrdshg；usaliunizatin；r9/l25；bell；hing粘膜是机

2、体与外界接触的重要屏障，也是外源抗原进入机体的主要门户。粘膜免疫系统包括那些与身体内外表相关的粘膜相关淋巴组织alt,分布在胃肠道、上下呼吸道和泌尿生殖道,它面积宏大,仅分布于人的胃肠道的面积就有400平方米,200倍于皮肤外表。安康成人alt中的免疫细胞占全身免疫细胞总数的80%，由此可见粘膜是人体的最大免疫器官。粘膜免疫系统担负着哨兵的责任，区分无害与有害,从而决定是放过去(免疫耐受)还是拦下来(免疫反响)1。这点在女性生殖道粘膜意义重大，其免疫应答既涉及对细菌病毒等病原体的抵御，又涉及同种异体的精子、胎儿的耐受，因此有其特殊性2。而长期以来因为女性生殖道缺乏典型的细胞和集合淋巴组织等被认

3、为是弱免疫效应部位而被研究者忽略，本文通过经小鼠生殖道粘膜免疫，来观察发生在生殖道部分的免疫应答，并试图解析其可能的机制。我们以前的研究已证明，用表达hg的重组乳酸杆菌经生殖道免疫小鼠可产生抗hgigg和iga的粘膜免疫应答，同时检测到生殖道部分有特异性抗体分泌细胞ass3，4。本文的目的是讨论b细胞as归巢到生殖道的分子机制。1材料与方法1.1材料雌性balb/小鼠购自中国科学院上海分院实验动物中心。1.2动物免疫1.3抗hgigg/iga抗体效价分析1.4固相酶联免疫斑点技术elispt法检测特异性hgigg/iga抗体分泌细胞加强免疫后第2周末，制备子宫淋巴细胞悬液，免疫磁珠阳性分选法分

4、别纯化各免疫组小鼠子宫b细胞。免疫磁珠阳性分选法如下：pbs洗涤子宫淋巴细胞2次，2500r/in离心10分钟；弃上清，用pbs/edta/fs缓冲液重悬细胞，计数细胞总数；2500r/in离心10分钟，完全弃上清，每107细胞参加pbs/edta/fs缓冲液90l重悬；每107细胞参加d19磁珠10l，充分混匀，在48孵育15分钟；每107细胞参加12l的缓冲液，2500r/in离心10分钟；弃上清，用500l缓冲液重悬；取一个ls别离柱，置于磁珠别离器上，用3l缓冲液冲淋别离柱后，将细胞悬液过柱，并用3l缓冲液3次冲洗别离柱，最后，加5l缓冲液用柱栓立即加压冲出磁珠标记的细胞，2500r/

5、in离心10分钟，即得到纯化的b细胞。经流式细胞术检测b细胞的纯度85%。1.6f分析子宫b细胞r9的表达1.7elisa检测子宫组织l25的表达剪碎子宫，1lpbs制备子宫组织上清，按elisa试剂盒说明操作，检测子宫组织上清l25的分泌程度。1.8统计学方法2结果2.1阴道灌洗液抗hgigg/iga抗体程度2.3子宫b细胞各趋化因子受体转录程度2.4子宫b细胞r9的蛋白程度2.5子宫组织l25的转录程度2.6elisa检测子宫组织l25分泌程度3讨论hg避孕疫苗经粘膜免疫的目的，是增加生殖道部分的特异性抗体程度，更好地起到避孕效果。我们以往的研究已证明，用表达hg的重组乳酸杆菌经生殖道免疫

6、小鼠可产生抗hgigg和iga的粘膜免疫应答3。同时检测到生殖道部分有特异性抗体分泌细胞ass，推测部分的特异性抗体主要是由归巢到生殖道的ass分泌的4。一直以来，因为女性生殖道缺乏典型的细胞和集合淋巴组织等被认为是弱免疫效应部位而被研究者忽略。然而，早在上世纪70年代就发如今口服脊髓灰质炎疫苗后可在子宫、宫颈和阴道分泌物中产生特异性抗体5。在动物实验中，部分给予不同的抗原，在生殖道部分都可产生特异的iga和igg抗体，证明在女性生殖道可诱导部分免疫应答6。人类女性生殖道粘膜系统表达的免疫球蛋白成分也有其特点，尽管有siga，但igg更丰富，不同于其他粘膜免疫应答的典型alt7。本研究结果显示

7、小鼠生殖道部分产生的抗体以igg型为主，as亦以igg为主，与上述理论相一致。淋巴细胞成功地归巢到一个靶器官，有赖于相关的趋化因子及粘附分子的参与，趋化因子及粘附分子的存在是淋巴细胞归巢的分子机制。有研究认为，趋化因子受体r10的配体l28在各种粘膜上皮组织的表达，可能是小肠igaass可以到达各种粘膜部位的原因，也是共同粘膜免疫系统的标志8。不同粘膜部位的淋巴细胞表达的粘附分子、趋化因子受体和粘膜上皮表达的粘附分子、趋化因子配体不同：呼吸道粘膜诱导的igaass，因为缺乏表达r9，所以被限制不能游走到小肠粘膜；归巢到皮肤的t细胞表达r10，但不表达47，就不能归巢到粘膜部位。本实验中子宫部分

8、b细胞上r7、r9、r10、xr4、xr5在各组均有表达，这些趋化因子受体都可能与b细胞归巢有关，但其中只有r9在免疫后表达明显增高，提示它与b细胞归巢到生殖道粘膜的关系可能比其他趋化因子更为亲密。r9/tek在小肠粘膜中研究最多。在人体，小肠中90%以上的t细胞都表达r9，无怪乎有人把r9当作生理条件下小肠中t细胞的代名词9，10。在小肠，除了t细胞的归巢，b细胞的归巢也与r9/tek有关。无论在小鼠还是在人，小肠粘膜淋巴组织中的igaass上均有r9表达。有学者认为，igaass可能利用r9/tek归巢到小肠。r9/tek对效应b细胞同样重要11。在本研究中，小鼠子宫组织中b细胞上r9在免疫后明显增高，提示r9/tek可能参与了生殖道b细胞的归巢，这似乎与小肠的归巢形式相似，提示r9/tek并非小肠粘膜归巢所独有，r9/tek亦可能在生殖道发挥作用。然而，即使在小肠r9也不是仅有的趋化因子，尚有其他如r7、r6、xr3、r5、xr4均参与t细胞的归巢。r9/tek可能与其他趋化因子及其受体一道参与生殖道b细胞的归巢。正是由于有非特异性的粘附分子如d44和特异性的粘附分子、趋化因子的表达，从而能定向的趋化诱导淋巴细胞到靶粘膜部分发挥作用，产生有效的免疫效应，构成了共同粘膜免疫应答和粘膜免疫部分反响特性的分子根底8。除了趋化因子和粘附分子，其他的可溶性分子如各种细