几种表达系统的比较

1、本文档来源于第一文库网： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342D1187081C.html 几种表达系统的比较生物技术通报综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN2002 年第2 期几种表达系统的比较吴丹 仇华吉 童光志（中国农科院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨 150001） 摘 要 : 随着蛋白质工程和 DNA 重组技术的发展 , 许多有应用潜力的蛋白分 子有待开发。不同蛋白在不同系统中表达水平有显著差异,所以选择一种合适的表 达系统对蛋白表达水平非常关键。对细菌、酵母、昆虫杆状病毒、哺乳

2、动物细胞4 种表达体系作一概述,并讨论各自优缺点及常见问题。关键词: 表达系统 大肠杆菌 酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞ComparisonofSeveralExpressionSystemsWuDan QiuHuaji TongGuangzhi (NationalKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnologynVeteriResearchInstitute ChineseAcademyofAgricultSciencesAbstract:Withthedevelopmentofrecombinant,manytypesofproteinthathavepotent

3、ial valuesneedtobeproduced.expressonlevelsamongdifferentproteinex2pressio nsystems.Soitscriticaltosystemforproteinproduction.Thisreviewwillsum2m arizetheadvantagesand,insectandmammalianexpressionsystems,andalsodis cussthesolutionstoKeywords Ecoli Yeast Insectcells Mammaliancells 随着生物化学和分子生物学技术的发展,使人

4、们得以更深入地了解蛋白质分子 的一级和二级结构,这样就可以有目的的进行改造,创建新的有价值的蛋白质分子。 为此,各种不同的表达体系应运而生,如细菌1、昆虫细胞2、酵母3、哺乳动物 细胞表达系统等。ATG 和 SD 序列,其在 SD 序列的位置和大小影响蛋白翻译效率。SD序列由3 9核苷酸组成,位于起始密码子上游3 11核苷 酸处。另一个重要调控本文档来源于第一文库网： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342D1187081C.html元件是转录终止子，它可以防止转录超出目的基因,并增加DNA分子稳定性。1.2 蛋白的加工 在原核细

5、胞胞浆的还原环境中表达的蛋白可形成不溶性包涵体,其中含有未折 叠的蛋白。这就需要采用再折叠的方法恢复蛋白活性。再折叠策略很多,需要针对 特定蛋白进行优化。大多策略包括分离包涵体、增加蛋白质的溶解度、在适当环境 下复性以形成正确的二硫键和恰当的空间构象。聚合体形成是在再折叠过程中要克 服的首要问题之一,通过降低再折叠混合物的浓度可使之降低至最小程度。另外,添 加增加稳定性的共溶剂(co-solven ts),如精氨酸，也可以促进再折叠过程。在错折叠 和未折叠的蛋白中共溶剂排斥的空间比天然的分子大,可促进分子的正确折叠。任何再折叠策略都需要优化许多重要参数,包括再折叠的温度、蛋白的浓 度、共大肠杆

6、菌表达体系大肠杆菌(E.coli)表达系统的优点是产量高、生长速度快、操作容易、成本低，其缺点是不能对表达蛋白进行糖基化修饰。 1.1 启动子等元件 为获得成功的表达,蛋白编码基因上下游需有合适的序列,确保蛋白有效转录和翻译。用于控制蛋白表达的关键元件是启动子。常用的启动子有入PLIac、trp启动子或其复合物，以及入PL启动子。启动子专司入DNA分子的 转录,受温敏阻遏物调控。T7RNA启动子可用于严格调控的高水平表达。原核生物的核糖体结合位点(RBS)是E.coli有效转录的第二个重要元件。 它包括起始密码子2002年第2期 吴丹等:几种表达系统的比较 31 溶剂和氧还偶的存在、反应的 p

7、H 值等。1.3 蛋白的分泌 采用前导序列可将蛋白直接分泌到细菌的周质腔隙中。常用的前导序列有pelB前导序列(来自Erwiniacarotocora的果胶酸盐裂解酶基因)和衍生于碱性磷 酸酶基因的前导序列。有时周质中的重组蛋白通过外膜“渗漏“到培养基中,这主 要决定于蛋白的氨基酸序列等,而非信号序列31。表达产物分泌到培养基中有利 于快速筛选,当产物产量很高时,可以从培养基上清中直接纯化。如果在上清中没有 发现产物,就需要从周质浸出物中分离蛋白,通常通过溶解的方法。本文档来源于第一文库网： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342

8、D1187081C.html细菌是一个重要的表达体系,特别对于不需糖基化的蛋白,并且表达水平很高。 但由于原核细胞表达体系简单,所以有其局限性,只适合少数蛋白。常需要富含 A 的序列,如可有效启动翻译的基序 AAAAAAATG。该表达体系对于外源基因序列的内在特性要求严格,A+T的含量在30 55%, 密码子的使用也具有选择性5。2.2 蛋白的修饰与加工在制订外源蛋白分泌表达策略时,可利用外源蛋白的天然信号肽来促成重组蛋 白的分泌,但有比较研究表明,利用外源蛋白的天然信号肽引导表达的重组蛋白较易 降解,而利用酵母蛋白信号肽引导表达的外源蛋白较为稳定23。通常采用S.cerevisi2aea-M

9、F、PichiaPastorisS.cerevisiaeSUC2。6。，其中包括 N-,相比 之下,酵母所加。新型酵母 PichiaPastoris酵母表达量很高，特别是新型酵母PichiaPas27toris的产量可达100 250mg/L。破伤风毒素片段C的表达量达到 12g/L25。酵母可进行高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重可达120g/L。兔抗 人的白血病抑制因子抗体在PichiaPastoris中表达量比在E.coli中增加100倍。 PichiaPastoris分泌的某些蛋白有多糖基化现象，如HIVgp12026,27。目前，对于 糖链的添加机制还知之甚少。 PichiaPast

10、oris 发酵培养产量高,但也有不尽人意之 处。目的蛋白产量增加的同时,也提高了其它细胞分泌的浓度,特别是蛋白水解酶。 在此环境下,有些蛋白稳定,而另一些蛋白则特别容易被降解。通常采用三种方法解 决:(1)补加氨基酸丰富的培养基,如蛋白胨或酪蛋白氨基酸,使其作为蛋白水解酶的底 物，以减少表达产物的降解28。(2)改变培养基的pH值16,PichiaPastoris可在 pH3 7的范围内生长，可将pH值调至蛋白水解酶活性区间之外。例如表a达 YNAGAL时就是通过维持pH5.5使产物保持稳定,而表达mEGF时则是通过维持 pH6.0和添加1%酪氨酸蛋白水解物以增加产量。使用蛋白水解酶基因缺陷的

11、 PichiaPastoris宿主菌(SMD1168),如在表达乳糖酶时，使用SMD1168较之正常受 体菌GS115表达量提高2倍29。酵母表达体系。肠杆菌不同的是,当,然后分泌到培养基中;,酵母可以在简单培养基中迅速生 长。可用酵母发酵技术对临床和工业上有用的重要蛋白进行了工业化生产。目前抗 体及其片段都用该系统进行了表达4。它还可以表达几乎所有植物蛋白。在大肠 本文档来源于第一文库网： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342D1187081C.html 杆菌中以包涵体形式出现的蛋白,在酵母中表达时可生成可溶性蛋白3,另外,该

12、系统 可以克服异源蛋白降解问题。2.1 转录、转译调控元件要使生长阶段和诱导阶段分开,启动子的严格调控至关重要,特别是表达有毒性 的毒素蛋白,否则在生长阶段会杀死宿主细胞。异源的启动子在酵母中无效,只有酵 母的启动子才能用于表达外源基因。常用的启动子有 GAL1、GAL7、GAL5、 AOX1 启动子,可被葡萄糖所抑制和被半乳糖或甲醇所诱导。许多选择性标记可用 于转化子的筛选，包括HIS4和抗生素Zeocin等。酵母的转录终止过程近似于高等 真核生物,包括转录终止、内切核苷酸加工、多聚腺苷酸化。在酵母中,5端非翻译区的二级结构和过高的G含量可抑制翻译的起始。起始 密码子ATG前通生物技术通报

13、32昆虫细胞表达体系Biotechnology Bulletin2002 年第2期除了以杆状病毒介导的昆虫细胞表达体系外,又开发比较新型的稳定转化系统, 用于大量制备具有功能活性的目的蛋白8,9。其表达水平高于哺乳动物细胞表达 系统,并且在表达真核蛋白时,可以对其进行翻译后修饰,其优越性远超过细菌表达体 系。 3.1 杆状病毒和宿主细胞在典型的杆状病毒载体中,外源基因由强大的多角体启动子所控制,以确保基因 高水平转录,便于重组病毒的筛选,并且可将重组蛋白大量分泌至培养液中。常用的 杆状病毒是Autographacaliforni2ca多核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕 (Bombyxmori

14、)多核型多角体病毒(BmNPV)。宿主细胞通常来源于双翅目昆虫，包 括果蝇、蚊子。其中有Schneider2和从Drosophilamelanogaster中衍生的 Kc。来源于Spodopterafrugiperda的是最常用的宿主细胞10。3.2翻译后的 修饰、 ,虽然糖,但寡糖链的性质有所不同,这可能是由于昆虫细胞不能将成熟糖链加 工成哺乳动物细胞中那样的形式11。杆状病毒表达载体的翻译后修饰还有磷酸 化、酰化、十六烷基化。曾有报道说，某些蛋白如乙肝表面抗原(Hb2sAg),在杆状病 毒中表达时还可被十四烷基化。蛋白前体的水解也很重要,虽然哺乳动物的蛋白分 泌信号在昆虫细胞中能被正确加工

15、,但其它蛋白裂解位点在昆虫细胞培养物中不能 够有效地或根本不能被识别12。 3.3 诱导表达杆状病毒表达体系能够方便、快 捷地表达外源蛋白,但主要缺点是外源蛋白表达受病毒晚期启动子的控制,蛋白产量 本文档来源于第一文库网： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342D1187081C.html 出现峰值时,细胞却由于病毒感染而即将死亡。Drosophilamelanogaster金属硫 因启动子是常用启动子，研究表明该启动子受到严格调控，当用重金属（如Cd、Cu）诱 导时，可实现高水平转录。虽然Cd可能有毒性，但添加少量Cd诱导时可将

16、表达量 提高30 100倍。抗生素如新霉素、潮霉素抗性基因被用作选择性标记，可与外源 基因进行共转染。杆状病毒表达体系能够高效表达目的蛋白。曾有报道说,每升感染的昆虫细胞 中重组蛋白可达1 500mg13。一种抗E-选择素的sFv在该系统中表达时培养 基上清可达到0.2 0.4mg/L水平,而在细菌表达系统中，无论在培养基上清中还是 可溶性周质浸出物中,均未检测到该蛋白的表达。外源蛋白的表达取决于许多因素, 优质培养和精心培养是必要的。要取得最佳结果,昆虫细胞必须富有活力并处于对 数生长期。昆虫细胞对氧需求很大,搅动是必要的,但又是危险的,因为搅动过程对高 度敏感的细胞形成很大压力。所要表达的

17、基因本身的特性是一个不容忽视的因 素,14,154效地识别。因为在哺乳动物细胞内质网中有完善的再折叠机构,也可以 对蛋白分子进行糖基化,因此适于表达完整的大分子蛋白。载体的选择取决于外源 基因导入哺乳动物细胞的方法和用来高效表达mRNA和合成蛋白的调控元件。有 两种方法可将外源基因导入哺乳动物细胞:一种是病毒感染介导的,另一种是用化学 方法（如脂质体法、磷酸钙法、 DEAE 沉淀法）和物理方法（如电转化法和微注射法） 将DNA直接导入细胞中。4.1 转录、转译调控因素转录调控元件（如启动子、增强子）的效率在不 同细胞系中有很大差异。启动子是影响外源基因表达效率的关键元件。因为细 菌的启动子和增

18、强子在动物细胞中不起作用,所以该系统调控元件大多分离自启动 效率高而且生物背景清楚的病毒基因组。其中 SV40、 AdMLP、 LTR、 CMV 在 CHO中效果较好。另一个转录元件是位于TATA框上游100 200bp处的增强子, 能增强转录起始速率。许多基因的另一个元件是mRNA帽子上游多拷贝的GC富 含区。只有将顺式作用元件合理、有效地构建至表达栽体,才能达到高效表达。在哺乳动物细胞中表达的所有克隆基因都包含核糖体结合位点和起始密码子。 真核核糖体靠识别序列GCCGCCA/GCCAUGG+416,17启动翻译,1 2002年第2期吴丹等:几种表达系统的比较336位的核苷酸位置及+4位的G

19、对克隆基因有效翻本文档来源于第一文库网： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342D1187081C.html译都很重要。增强子可用于增强表达,许多增强子受细胞类型的限制。像SV40、CMV和劳斯肉瘤病毒的LTR在许多类型细胞 中都有活性,只是表达量有差异。在启动子确定的情况下,可通过引入指导前体 mRNA合成的内含子序列、促进mRNA翻译的序列、拼接一个信号前导肽、解决 密码子偏爱性等途径来提高表达水平30。 4.2 用于表达的细胞系稳定细胞系的 筛选比较费时。瞬时表达系统可作为遗传工程构建是否正确的早期指征。基因工程 嵌合抗体通

20、常用COS细胞进行瞬时表达18,19。病毒转染的CHO-K1细胞系通 常也用于蛋白的瞬时表达20。采用导源启动子、增强子和可扩增的遗传标记,可 提高蛋白产量。一般选择的遗传标记是一些便于分析的、，E.coli的LacZ基因 比较了表达Ig物细胞表达体系22,二氢叶酸的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)和谷氨 酰胺的鼠NSO骨髓瘤细胞合成酶系统可产生相同产量的抗体，但在CHO细胞中抗体基因拷贝数和可选择标记基因 的拷贝数高于NSO细胞。4.3存在的问题目前该系统存在的问题有:(1)产率低;(2)某些糖基化产物不稳定、不易纯化;(3) 重组细胞上游与下游工作脱节,构建时着重考虑它的高效表达,而对表达产物

21、是否能 有效地纯化则考虑较少;(4)费用昂贵,自动化水平低。结语,它们有各种的优缺点(见表1)。 ,如、是否是毒、是否需大量表达、如。每种 蛋白的表达都会遇,没有通用的表达系统可用。有些蛋白表达量本身就少,这就需要 研究者在表达特定蛋白分子时优化实验条件或对蛋白基因进行特殊改造以提高表达 量。表 1 各种表达体系的特性比较表达体系原 大肠杆菌核体系 酵母甲醇营养型真酵母核体昆虫细胞系哺乳动物细胞系统优缺点具有良好的可操作性,成本低,但不能进行糖基化修饰,胞内形成包涵体本文档来源于第一文库网： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342

22、D1187081C.html兼具原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工能力,但存在产量低及过度 糖基化等问题第二代酵母表达系统,部分克服了过度糖基化缺点,有较好的分泌性,产量较高,但 产物结构与天然分子仍有一些差异。具有高等真核生物表达系统的优点,产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋 白质相似,表达水平较高,但糖基化程度较低,形式单一。产物的抗原性、免疫原性和 功能与天然蛋白质最接近,糖基化等后加工最准确,但表达水平较低。产量夕卜源蛋白10% 70%胞内表达,0.3% 4%胞外表达外源蛋白约占菌体总蛋白的10%夕卜源蛋白占菌体总蛋白的10 30%夕卜源蛋白占菌体总蛋白的1 500mg/L发酵

23、液中表达产物含量为0.2 200mg/L参考文献B,etterM,ChangCP,RobinsonRR,etal.Science,1988,240:1041.BeiR,SchlomJ,KashmiriSV.JImmunolMethods,1995,186 245.RidderR,SchmitzR,LegayF,etal.Bio/Technology,1995,13:255.WoodC,BossMA,KentenJH,etal.Nature,1985:314 446.生物技术通报345彭毅，杨希才,康良仪生物技术通报,2000(4):33 36.Biotechnology Bulletin200

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