蛋白质快速检测仪测定乳及乳制品中蛋白质

1、蛋白质快速检测仪测定乳及乳制品中蛋白质引言 蛋白质是生命现象中最基本的物质基础 , 具有调节生理功 能 , 充当药物分子、维生素、矿物质与微量元素的载体等功能。 食用乳及乳制品是人体摄入蛋白质的重要途径之一。 为了保证乳 及乳制品的质量 , 我国在生乳安全标准、 GB/T5410-2008 乳粉和 NY 5045-2001 无公害食品 生鲜牛乳等标准中都明 确规定了乳及乳制品中蛋白质含量要求。 但一些不法分子为了获 取经济利益 , 向乳制品中添加含氮量高的无机物质（如三聚氰 胺、尿素、硝酸铵等）以提高蛋白质的含量 , 严重影响乳制品的 质量和人们的身体健康。 有关乳及乳制品中蛋白质含量不达标所

2、 引起的食品中毒事件时有发生 , 乳制品安全引起了社会极大关 注。我国和国际上均出台了一系列标准的乳及乳制品中蛋白质含 量的测定方法，如凯氏定氮法1,2 、杜马斯燃烧法35 等。凯氏定氮法是我国用于蛋白质测定的常规检测方法 , 它是通 过样品消解将样品中所有氮元素转化为氨，通过H2S0载HCI标 准溶液进行滴定 , 实现样品中蛋白质的测定 , 完成一个样品的 整个分析过程至少需要 2 h 。从其原理可知 , 样品消解后所有氮 元素均转化为氨 , 故该法无法区分蛋白质氮与非蛋白质氮。 2001 年, 国际标准化组织和国际乳品联合会发布了乳制品中非蛋白 氮的测定标准方法 6 , 该法提出了蛋白氮和

3、非蛋白氮分离方法 , 弥补了凯氏定氮法不能区分蛋白氮和非蛋白氮的缺陷 , 该 方法我国于 2008 年等同引用 7。杜马斯燃烧法是国际上常用 于蛋白质含量测定的方法。 样品燃烧后生成的氮氧化物在钨上还 原为分子氮，分子氮由二氧化碳载气运送到TCD热导检测器，氮含量引发一种电子测量信号 , 经过标准物质独立校正被测样 品中氮含量 , 然后转换为蛋白质的含量。 从原理上看 , 如不对样 品进行预处理 , 该方法与凯氏定氮法同样也无法区分蛋白质氮 和非蛋白质氮。 本研究开发出一种能够对乳及乳制品中蛋白质快 速、准确、定量且不受非蛋白质氮干扰的蛋白质快速检测仪 8。实验部分仪器与试剂GDY N-200

4、S蛋白质快速检测仪（长春吉大 小天鹅仪 器XX公司）；Setra BL-120S分析天平（美国西特 Setra公司）； 奶粉中蛋白质标物（BW3832-1/ BW3832-2/ BW3832-3购于国家 标准物质研究中心； 蛋白质试剂 （主成分为偶氮染料 , 长春吉大 小天鹅仪器XX公司）：将蛋白质试剂全部转移至2 L蛋白质试剂分取器 , 用水稀释至 2 L, 备用。实验方法样品前处理 （ 1 ）牛奶 准确称取 1.000 g 牛奶于塑 料样品杯中 , 注入 40 mL 蛋白质试剂 , 搅拌 1 min, 以 12000 r/min 离心 3 min, 上清液为待测溶液。（2）奶粉 准确称取

5、10.000 g 奶粉于塑料样品杯中 , 加入 90 mL 蒸馏水 , 搅拌 3 min, 此溶 液为奶粉稀释液。 其它步骤同牛奶蛋白质测定步骤。 （ 3）鸡蛋 取 2.000 g 搅拌均匀的生鸡蛋液 , 加入 1.0 mL 鸡蛋蛋白质前处理 试剂和7 mL蒸馏水，摇匀，准确称取0.500 g上述处理后鸡蛋 样品于塑料样品杯中 , 注入 40 mL 蛋白质试剂 , 搅拌 1 min, 分 取搅拌后溶液 , 以 12000 r/min 离心 3 min, 上清液为待测溶液。222测量 以蒸馏水为空白，通过GDYN-200S蛋白质快速 检测仪检测蛋白质试剂反应前后吸光度 , 根据仪器内置数据处 理

6、系统计算样品中蛋白质的含量。蛋白质快速检测仪原理和结构仪器的分析原理 将某些有机试剂适量加入到含有蛋白质的溶液中时 , 有机试剂与蛋白质相互作用生成不溶性化合物 （这些有机试剂可称为 蛋白质试剂） , 离心分离不溶性化合物 , 未与蛋白质反应的有机 试剂仍存在溶液中。 通过定量加入的有机试剂 , 借助蛋白质快速 检测仪检测有机试剂吸光度的变化 , 可测定出样品中蛋白质的 含量。因为溶液吸光度与有机试剂的浓度成正比 , 当蛋白质存在 时, 溶液中有机试剂浓度降低 , 其溶液吸光度也降低 , 降低程 度与蛋白质浓度相关 9。蛋白质快速检测仪结构 蛋白质快速检测仪主要由样品称量、 显色分离和测量 3

7、部分构成 , 其中称量部分由分析天平完成 , 通过数据线直接将数据 传输到GDYN-200S蛋白质快速检测仪。蛋白质检测仪结构如图1 所示 , 主要由光源 , 比色池、 检测器、 硬件驱动系统和显示系统 等构成。采用中心波长为 483 nm 的超高亮发光二极管（ LED） 10 作光源 , 该光源又作为单色器 , 使用寿命为 106 h 。与传统便携 式分光光度计相比 , 仪器无需光栅和棱镜等分光器件 , 简化了 仪器光路系统 , 降低成本 , 增加了仪器的抗震和抗干扰能力。 蛋 白质试剂在 483 nm 处具有较大摩尔吸光系数 , 如采用传统的光 程为 1 cm 比色池, 需稀释后才能测量。

8、为了减少样品稀释引起 的测量误差，该仪器的比色池采用光程仅为2 mm流通式结构，借助注射器实现被测样品的引入。检测器为TSL系列集成光频转换器, 可直接将光信号转化为频率信号实现光频数字化检测。 微 控制器采用32位ARM AT91SAM7S25作为仪器的逻辑控制核心， 可直接对TSL系列光频转换器的输出频率进行计数,从而得到 透射光的强度值。程序采用ARM匚编与C语言编写，开发工具为 GNUarm-elf-toolchain, 嵌入式控制软件整体流程如图 2 所示。结果与讨论蛋白质试剂光谱图采用紫外可见分光光度计对蛋白质试剂及其与蛋白质反应 离心后的上清液进行光谱扫描（图 3）。从图 3可见

9、, 蛋白质试 剂在 483 nm 处具有较强的特征吸收（曲线 1）。当样品中蛋白 质与试剂发生特异性反应 , 用紫外可见分光光度计扫描上清液 , 发现上清液（即未反应的蛋白质试剂）在 483 nm 处仍有一个较 强的特征吸收峰 （曲线 2）, 其吸收峰形状和位置未发生改变 , 但 吸光度强度明显降低 , 且随着蛋白质含量的增加其降低程度增 大。同时发现 , 蛋白质试剂反应前后吸光度变化值与待测物质中 蛋白质的含量具有一定关系 , 即, 其中 , 为蛋白质试剂反应前 后吸光度变化值； 为蛋白质浓度； 为吸收系数 , 即表示蛋白质浓 度变化 1 个单位引起的吸光度值的变化。 据此, 本研究建立了蛋

10、 白质的快速测定方法。检测仪选用 483 nm 的超高亮发光二极管 作为光源。温度对测定结果的影响 考察了不同温度对蛋白质含量测定的影响。 如表 1 所示, 在 温度1740 C范围内，温度对GDYN-200S蛋白质快速检测仪测 定样品中蛋白质（标准值 3.07%）无影响。时间对测定结果的影响 考察了蛋白质试剂与蛋白质反应时间对测定结果的影响 , 结果表明，在室温条件下，搅拌1 min样品中的蛋白质可与蛋白 质试剂发生特异性反应； 同时考察蛋白质试剂反应后上清液的稳 定性，由表2可见，在2 h内测定的A和B两牛奶样品的蛋白质 含量保持不变。整个蛋白质测定过程仅需510 min, 与凯氏定氮法

11、23 h 相比, 检测时间显著缩短。测定结果的重复性考察了 GDYN-200S蛋白质快速检测仪对样品测定结果的重 复性。对A、B两牛奶样品蛋白质含量重复测定11次，其测定结 果的精密度分别为0.9%和0.5%,表明GDYN-200S蛋白质快速检 测仪测定结果具有良好的精密度。干扰试验从蛋白质检测仪原理可知 , 检测信号为蛋白 质试剂反应前后吸光度变化值。 向蛋白质试剂中添加一定量的三 聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸铵等非蛋白氮物质 , 以验证非蛋白 氮是否干扰蛋白质的测定 , 结果如表 3所示。通过紫外 -可见分 光光度计扫描可知 , 三聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸铵等添加物 在 483 nm 处均

12、无吸收 , 当加入蛋白质试剂时 , 未见不溶性化合 物生成 , 蛋白质试剂溶液吸光度也未发生变化 , 表明三聚氰胺、 尿素、甘氨酸、硝酸铵等未与蛋白质试剂反应 , 不影响蛋白质的 测定。向鲜奶样品中添加三聚氰胺 , 结果如表 4 所示, 当三聚氰 胺添加量w 0.1 g/20 mL时，添加与不添加三聚氰胺对测定结果 无影响；但添加量过高时 , 蛋白质测定结果偏低 , 这是因为随着 三聚氰胺添加量的逐渐增加 , 蛋白质在添加了三聚氰胺的样品 中的质量分数逐渐降低所致。蛋白质快速检测仪的应用将研制的GDYN-200SS白质快速检测仪应用到新鲜乳、 市售 纯牛奶、牛奶饮料 （核桃、 燕麦、红枣）、奶

13、粉（包括牛初乳粉） 、 豆浆粉、豆奶粉和鸡蛋等 500 个样品中蛋白质的定量测定 , 并与 凯氏定氮法进行比较 , 同时测定了 3 种奶粉中蛋白质标准物质 , 部分结果见表 5 所示。从检测数据可知 , 与凯氏定氮法测定结果（依据国家标准方法 1,7 分别测定样品中的总氮和非蛋白氮 , 二者差减后计算出样品中真实的蛋白质含量）与标准物质相比 , 其相对误差均小于 5%。从实验结果可知 , 蛋白质试剂可快速定量与样品中蛋白质 发生反应（ 1 min ） , 且能稳定 2 h, 单一样品全程检测周期仅 需510 min ;因蛋白质试剂仅与蛋白质氮特异性反应，避免了三聚氰胺、尿素、甘氨酸和硝酸铵等非

14、蛋白氮的干扰；同时该仪 器和方法操作简单 , 避免了传统检测方法消解、 蒸馏和滴定等复 杂步骤 , 适用于实际样品中的蛋白质定量检测。ReferencesGB/T 5009.5-2010, Determination of Protein in Foods （食品中蛋白质的测定） . National Standards of thePeople s Republic of China（中华人民共和国国家标准）GB/T 5410-2008, Milk Powe（r 乳粉）. National Standardsof the Peoples Republic of China（中华人民共和国国家

15、标准）ISO 14891/IDF 185: 2002 Milk and Milk Products-Determination of Nitrogen Content-Routine Method Using Combustion According to the Dumas PrincipleMarco A, Rubio R, CompanoR, Casals I. Talanta, 2002, 57: 1019 1026Saint-Denis T, Goupy J. Analytica Chimica Acta, 2004,515: 191 198ISO 8968-4/IDF 20-4:

16、2001 Milk-Determination ofNitrogen Content Part 4: Determination ofNon-protein-nitrogen ContentGB/T 21704-2008, Determination ofNon-protein-nitrogen Content in Milk and Dairy Products （乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定） . National Standards of the People s Republic of China（中华人民共和国国家标准）YU Ai-Min, WANG Zhen-De （于爱民 ,

17、王振德） . China Patent （中国专利） , ZL200820209752.9WANGing-Yan, ZHUSheng-Geng, XUChang-Fa （王镜岩， 朱圣庚 , 徐长法） . Biochemistry （生物化学） Beijing （北 京） : Higher Education Press （高等教育出版社） , 2002: 300YU Ai-Min, WANG Zhen-De （于爱民 , 王振德） . ChinaPatent （中国专利） , ZL200720003016.3Fast Determination of Protein in Milk and

18、DairyProducts Using Protein Fast AnalyzerFENGXu-Dong1, AN Wei-Dong2, DINGYi1, YUAi-Min1, LIU Jing3,GAO De-Jiang3, WANG Zhi-Hong4, YU Yong41（College of Chemistry, Jilin University, Changchun 130012）2( Jilin Institute of Metrology, Changchun 1300223(Changchun Jilin University-Little SwanInstruments Co

19、., Ltd., Changchun 130012 )4( College of Instrumentation & Electrical Engineering, Jilin University, Changchun 130012 )A rapid analyzer for the determination of protein were developed. The effects of experimental parameters, including temperature, time, and foreign substances were investigated. Several milk and dairy products were analyzed using the protein fast analyzer. The exp