毕业论文-基于ITS2序列的中药材南蛇藤及雷公藤溯源研究

1、PAGE PAGE 1PAGE PAGE 16 本科生毕业设计（论文）基于ITS2序列的中药材南蛇藤及雷公藤溯源研究 Study the Celastri Orbiculatus Radix and Tripterygii Wilfordii RadixTraceability Based on Internal Transcribed Spacer 2 Barcode基于ITS2序列的中药材南蛇藤及雷公藤溯源研究基于ITS2序列的中药材南蛇藤及雷公藤溯源研究 摘要目的：应用DNA条形码ITS2对中药药材南蛇藤及雷公藤进行溯源研究，。方法：构建南蛇藤属及雷公藤DNA条形码数据库，依据DNA条形

2、码标准操作规程（SOP），鉴定市场供应的药材南蛇藤与雷公藤。结果：15份南蛇藤中有9份正品，5份伪品，另外1份未获得序列；7份雷公藤药材中有2份正品，5份伪品。结论：该方法实现了对药材市场供应的南蛇藤、雷公藤药材的快速、准确鉴定，同时证实了ITS2序列作为药材可追溯技术的可靠性。 关键词ITS2序列；DNA条形码；南蛇藤；溯源；Study the Celastri Orbiculatus Radix and Tripterygii Wilfordii Radix Traceability Based on Internal Transcribed Spacer 2 Barcode Scienc

3、e of Chinese Materia Medica MajorSU Jin Abstract: In this study,we detected the species composition of Celastri Orbiculatus Radix and Tripterygiiwilfordii Radix using ITS2 sequence as the traceability technology.A genus Celastrus DNA barcode database was successfully constructed using 50 voucher sam

4、ples from 12 Celastrus species. Based on the DNA barcoding standard operating procedure(SOP) , we used this database to identify Celastri Orbiculatus Radix and Tripterygiiwilfordii Radix decoction piece samples that were purchased from market randomly.The results showed that only 9 decoction piece s

5、amples were authentic Celastrus orbiculatus Thunb.,and only 2 decoction piece samples were authentic TripterygiumwilfordiiHook. F.,whereas the others were all Adulterants.Conclusion: this method is realized to the rapid and accurate identification of Celastri Orbiculatus Radix and Tripterygiiwilford

6、ii Radix that were purchased from market randomly, also confirmed the reliability of the ITS2 sequence as traceability technology. Key words: ITS2；DNA barcoding；Celastri Orbiculatus Radix；Traceability目录 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc448097084 1 文献综述 PAGEREF _Toc448097084 h 6 HYPERLINK l _Toc448097

7、085 1.1南蛇藤及其混淆品概述 PAGEREF _Toc448097085 h 6 HYPERLINK l _Toc448097086 1.2南蛇藤及其混淆品性状特征 PAGEREF _Toc448097086 h 7 HYPERLINK l _Toc448097087 1.3南蛇藤及其混淆品化学成分 PAGEREF _Toc448097087 h 7 HYPERLINK l _Toc448097088 1.4南蛇藤及其混淆品药理作用研究 PAGEREF _Toc448097088 h 8 HYPERLINK l _Toc448097089 1.5 DNA条形码技术 PAGEREF _To

8、c448097089 h 8 HYPERLINK l _Toc448097090 1.6 ITS2序列 PAGEREF _Toc448097090 h 8 HYPERLINK l _Toc448097091 2 引言 PAGEREF _Toc448097091 h 9 HYPERLINK l _Toc448097092 3 实验材料 PAGEREF _Toc448097092 h 9 HYPERLINK l _Toc448097093 4 方法 PAGEREF _Toc448097093 h 11 HYPERLINK l _Toc448097094 4.1 DNA提取 PAGEREF _Toc

9、448097094 h 11 HYPERLINK l _Toc448097095 4.2 PCR扩增及检测 PAGEREF _Toc448097095 h 11 HYPERLINK l _Toc448097096 4.3 数据处理 PAGEREF _Toc448097096 h 11 HYPERLINK l _Toc448097097 5 结果与分析 PAGEREF _Toc448097097 h 11 HYPERLINK l _Toc448097098 5.1 扩增及测序成功率 PAGEREF _Toc448097098 h 11 HYPERLINK l _Toc448097099 5.2

10、变异位点分析 PAGEREF _Toc448097099 h 11 HYPERLINK l _Toc448097100 5.2.1 南蛇藤属各药用植物及雷公藤变异位点分析 PAGEREF _Toc448097100 h 11 HYPERLINK l _Toc448097101 5.2.2 南蛇藤属种间及种内遗传距离分析 PAGEREF _Toc448097101 h 12 HYPERLINK l _Toc448097102 5.2.3 南蛇藤与雷公藤遗传距离分析 PAGEREF _Toc448097102 h 13 HYPERLINK l _Toc448097103 5.3 鉴定市场供应的商品

11、药材南蛇藤与雷公藤 PAGEREF _Toc448097103 h 13 HYPERLINK l _Toc448097104 5.4 系统发育邻接树分析 PAGEREF _Toc448097104 h 14 HYPERLINK l _Toc448097105 6 讨论 PAGEREF _Toc448097105 h 15 HYPERLINK l _Toc448097106 7 结论 PAGEREF _Toc448097106 h 16 HYPERLINK l _Toc448097107 参考文献 PAGEREF _Toc448097107 h 16 HYPERLINK l _Toc448097

12、108 致谢 PAGEREF _Toc448097108 h 181 文献综述1.1南蛇藤及其混淆品概述南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.）为民间习用药材。又称：金银柳(盛京通志)，金红树、果山藤(狄尔士中国植物名录)，药狗旦子(迈尔氏中国植物名录)，蔓性落霜红(中国树木分类学)，过山风、挂廊鞭。香龙草(中国药植志)，穷搅藤、老石棵子(东北药植志)，地南蛇、过山龙( HYPERLINK /doc/3077221-3243305.html t _blank 江西中药)，大伦藤、大南蛇、白龙、老龙皮、臭花椒( HYPERLINK /doc/4027470-422503

13、6.html t _blank 湖南药物志)，穿山龙(泉州本草)， HYPERLINK /doc/7368171-7635332.html t _blank 老牛筋(东北常用中草药手册)。南蛇藤是我国分布最广的种之一，黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山东、山西、河南、陕西、甘肃、江苏、安徽、浙江、江西、湖北、四川等地均可见其踪迹；国外分布达俄罗斯、朝鲜、日本。南蛇藤根藤、果、叶均可入药。全年可采根、藤；夏季采摘叶；秋季采集果。晒干或鲜用均可。据常用中草药配方记载，其性味“微辛，温，无毒”可祛风湿，活血脉。主治筋骨疼痛，四肢麻木，小儿惊风，痧症，痢疾等症。现市面上常将南蛇藤与其同科的有毒植物雷

14、公藤混淆使用，威胁临床用药安全。1.2南蛇藤及其混淆品性状特征南蛇藤其原植物为落叶攀援灌木，高达3-8m小枝光滑无毛，灰棕色或棕褐色，具稀而不明显的皮孔；腋芽小，卵状到卵圆状，长1-3毫米。叶通常阔倒卵形，近圆形或长方椭圆形，长5-13厘米，宽3-9厘米，先端圆阔，具有小尖头或短渐尖，基部阔楔形到近钝圆形，边缘具锯齿，两面光滑无毛或叶背脉上具稀疏短柔毛，侧脉3-5对;叶柄细长1-2厘米。聚伞花序腋生，间有顶生，花序长1-3厘米，小花1-3朵，偶仅1-2朵，小花梗关节在中部以下或近基部;雄花萼片钝三角形;花瓣倒卵椭圆形或长方形，长3-4厘米，宽2-2.5毫米;花盘浅杯状，裂片浅，顶端圆钝;雄蕊长

15、2-3毫米，退化雌蕊不发达;雌花花冠较雄花窄小，花盘稍深厚，肉质，退化雄蕊极短小;子房近球状，花柱长约1.5毫米，柱头3深裂，裂端再2浅裂。蒴果近球状，直径8-10毫米;种子椭圆状稍扁，长4-5毫米，直径2.5-3毫米，赤褐色。花期5-6月，果期7-10月1。雷公藤原植物为藤本 HYPERLINK /view/84139.htm t _blank 灌木，高1-3米，小枝棕红色，具有4-6根细棱，被密毛及细密皮孔。叶椭圆形、倒卵椭圆形、长方椭圆形或卵形，长4-7.5厘米，宽3-4厘米，先端急尖或短渐尖，基部阔楔形或圆形，边缘有细锯齿，侧脉4-7对，达叶缘后稍上弯；叶柄长5-8毫米，密被锈色毛。

16、HYPERLINK /view/135981.htm t _blank 圆锥聚伞 HYPERLINK /view/16103.htm t _blank 花序较窄小，长5-7厘米，宽3-4厘米，通常有3-5分枝，花序、分枝及小花梗均被锈色毛，花序梗长1-2厘米，小花梗细长达4毫米；花白色，直径4-5毫米；萼片先端急尖；花瓣长方卵形，边缘微蚀；花盘略5裂；雄蕊插生花盘外缘，花丝长达3毫米；子房具3棱，花柱柱状，柱头稍膨大，3裂。 HYPERLINK /view/321350.htm t _blank 翅果长圆状，长1-1.5厘米，直径1-1.2厘米，中央果体较大，约占全长2/3-1/2，中央脉及2

17、侧脉共5条，分离较疏，占翅宽2/3，小果梗细圆，长达5毫米；种子细柱状，长达10毫米1。1.3南蛇藤及其混淆品化学成分南蛇藤的化学成分比较复杂，现已从其根皮、种子、叶、地上部分中分离得到了-二氢沉香呋喃型倍半萜类及其衍生物，及一些二萜三萜类化合物以及生物碱。此外还有甾体类、鞣质、有机酸、黄酮类等。其中萜类、生物碱、黄酮类含量较高2。雷公藤根含雷公藤碱（wilfordine），雷公藤次碱（wilforine），雷公藤碱乙（wilforgine），雷公藤碱丁即雷公藤春碱（wil-皮 HYPERLINK /view/321266.htm t _blank 酰胺（celacinnine）， HYPER

18、LINK /view/41213.htm t _blank 南蛇藤- HYPERLINK /view/2317865.htm t _blank 呋喃甲酸胺（celafurine），雷公藤内酯（wilforlide）A、B，雷酚萜醇（triptonoterpenol），16-羟基雷公藤内酯醇（16-hydroxytripto-lide），雷公藤内酯醇即雷公藤甲素（triptolide）等成分。1.4南蛇藤及其混淆品药理作用研究现发现南蛇藤果实水煎液及提取的粗油具有镇静催眠作用。南蛇藤根水煎液对炎症的早晚期治疗具有良好的效果，且具有一定的镇痛作用。南蛇藤的提取物对大肠杆菌，流感病毒等病原微生物均有

19、明显的预防和治疗作用。现临床用于治疗风湿类风湿性关节炎，血液病等11。且临床研究表明南蛇藤具有一定的毒性，服用后会引起胃肠道反应。雷公藤则具有免疫调节，抗肿瘤，改善微循环，抗炎、杀菌以及解热镇痛等作用。临床常用于类风湿性关节炎、麻风、红斑狼疮、皮肌炎、混合型结蒂组织病、干燥综合症、多形性红斑、各种类型的血管炎、酒糟鼻、与关节病性和 HYPERLINK /view/2364298.htm t _blank 脓疱型银屑病等。其毒性远大于南蛇藤，且其中毒量与治疗剂量极为相近。中毒后会出现眩晕，头昏头痛，全身疲乏，肢麻肌痛，痉挛甚而抽搐。胸闷，心悸，心痛，气短，血压下降，心跳减弱，心律不整，紫绀，体温

20、下降，休克。恶心呕吐，口干，纳呆，腹胀腹痛，腹泻或便秘，全身黄疸。上述中毒症状持续23日后出现急性肾功能衰竭，浮肿，腰痛，尿少，严重时可出现尿毒症而致死。1.5 DNA条形码技术DNA条形码（DNA barcode）是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码已经成为 HYPERLINK /view/1087411.htm t _blank 生态学研究的重要工具，不仅用于物种鉴定，同时也帮助生物学家进一步了解 HYPERLINK /subview/24042/24042.htm t _blank 生态系统内发生的相互作用。在发现一种未知物种或者

21、物种的一部分时，研究人员便描绘其组织的DNA条形码，而后与国际数据库内的其他 HYPERLINK /subview/13740/13740.htm t _blank 条形码进行比对。如果与其中一个相匹配，研究人员便可确认这种物种的身份。 DNA条形码技术是利用生物体DNA中一段保守片段对物种进行快速准确鉴定的新兴技术。自古以来的中药鉴定，通常是通过中药的性状进行鉴定或者一些简单的理化反应进行鉴定，而DNA条形码技术则实现了通过生物个体、居群或物种基因中具有差异特征的DNA片段来鉴定，这有效地弥补了传统鉴定方法所受到的一些限制。其与传统鉴定方法相比主要具有鉴定结果重复性优良，鉴定方法通用性较佳，

22、可以建立统一的鉴定平台和数据库等优点20。1.6 ITS2序列在 rDNA HYPERLINK /view/8563.htm t _blank 基因中，5.8S rDNA 和 28S rDNA 基因间隔序列称为（ITS），它的长度和序列变化较大，将其 HYPERLINK /view/3853396.htm t _blank 扩增物进行 RFLP 或序列分析，可用于对真菌的不同 HYPERLINK /view/920620.htm t _blank 生物型、 HYPERLINK /view/845922.htm t _blank 菌株、种、属进行分类鉴定。甚至用于区分关系非常近的种。ITS2是真

23、核生物rDNA的一段顺反子，位于5.8S和28SrRNA之间，由于该序列具有适合扩增和测序的长度，有利于对发生降解的样品进行扩增，同时,ITS2片段在物种水平的变异较快，有更多的突变位点以区分不同的物种。2010年中国学者提出将ITS2作为药用植物标准DNA条形码，并psbA-trnH 作为ITS2 的补充序列。2 引言南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.）系卫矛科（Celastraceae）南蛇藤属(Celastrus L.）植物1。该属植物入药的有15种，如灯油藤C.Panicuatta、青江藤C.hindsii、刺南蛇藤C.flagellaris等,常用于治疗

24、筋骨疼痛、风湿性关节炎、腰腿痛、跌打损伤、痈肿疮疡等病症2-10。南蛇藤作为南蛇藤药材的基原物种常以其根入药，治疗风湿性关节炎和类风湿性关节炎，同属药用植物亲缘关系近，性状差异小，容易其与混伪。南蛇藤是有毒中药，尚有山砒霜之称,服用后有胃肠道反应,表现为轻度的胃部不适、恶心、呕吐等，但其毒副作用比同科雷公藤属植物雷公藤（Tripterygium wilfordii level.Hook.f.）小11。有关文献记载，南蛇藤与雷公藤在市场上存在混用现象12，传统的显微鉴定，理化鉴定存在一定的局限性。总之，为了其临床用药安全、有效，有必要对南蛇藤及雷公藤药材其进行溯源研究。有关南蛇藤鉴别研究相对较少

25、，仅见性状鉴别和显微鉴别等13。DNA条形码技术是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的分子生物学技术，具有快速准确、简单有效的特点，是传统生物鉴定方法的有效补充14。Chen S L等15提出将ITS2序列作为药用植物鉴定标准DNA条形码序列得到了广泛认可16。应用DNA条形码技术对物种进行鉴定和分类已成为生物分类学的研究热点17-18。本研究利用ITS2条形码对南蛇藤及其混伪品进行比较研究，旨在为该药材的质量控制、临床安全用药及合理开发利用提供分子依据。3 实验材料 样品经中国科学院武汉药用植物园赵子恩研究员鉴定，凭证标本保存于湖北中医药大学药学院。实验样品及来自Ge

26、nBank所下载序列，见表1。另包括从不同的药材市场购买南蛇藤药材15份（HB0695MT12-26），雷公藤药材7份（HB3250MT07-13）。表1 实验样品及下载序列信息编号种名采集地样本编号GenBank登录号1南蛇藤Corbiculatus湖北恩施、湖北神农架、江西庐山HB0695MT01-112显柱南蛇藤Cstylosus湖北恩施HB0693MT01-02,HB0694MT03-04,HB0697MT06-07,JQ4241363皱果南蛇藤Ctonkinensis湖北恩施、湖北神农架HB0692MT01-05JQ4241384苦皮藤Cangulatus湖北神农架HB0688MT0

27、4-05EU328759-60,JQ4240975粉背南蛇藤Chypoleucus湖北神农架HB0694MT02-03JQ424111,JQ4241226长序南蛇藤Cvaniotii湖北恩施HB0699MT01-02JQ424139-1407小南蛇藤Ccuneatus湖北恩施HB0689MT01-028短梗南蛇藤Crosthornianus湖北恩施HB0696MT01EU3287629宽叶短梗南蛇藤Crosthornianus Loes.湖北恩施HB0697MT01-0210雷公藤T. wilfordii湖北恩施HB325MT02-06FJ980418, GQ434766,HM115962,

28、JQ42414811灯油藤CpaniculatusJQ424125-126,KF54489012皱叶南蛇藤CrugosusJQ424132-13313刺苞南蛇藤CflagellarisJQ424100-1014 方法4.1 DNA提取 用75%乙醇擦拭实验样品表面，刮去外表皮，分别取实验材料的干燥叶片30 mg，用球磨仪（Retsch MM400，Germany）研磨2 min（30 次/s），然后用改良的CTAB法19提取植物总DNA。4.2 PCR扩增及检测 采用通用引物、反应条件及程序对总DNA进行PCR扩增20，PCR反应体系以25 L为参照，包括2PCR Mix 12.5 L，引物对

29、ITS2 P3/E4(2.5 mol L-1)各1 L ，模板DNA2 L，灭菌双蒸水8.5 L。设置未加模板DNA的PCR反应为阴性对照。PCR程序参见中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则 18。 应用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，38份样品的PCR经电泳后均能显示单一条带，测序后均得到高质量ITS2序列峰图。 4.3 数据处理应用CondonCode Aligner V 4.2.4（CondonCodeCo，USA）软件对测序峰图进行校对拼接，基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8S和28S区段，获得ITS2间隔区序列21。利用MEGA（Molecular Evolut

30、ionary Genetics Analysis）6.0 进行序列比对分析22，计算种内、种间Kimura-2-Parameter（K2P）遗传距离，构建系统邻接（Neighbor Joining，NJ）树23。5 结果与分析5.1 扩增及测序成功率实验结果表明ITS2对38份基源植物样本的扩增及测序成功率均为100。对南蛇藤药材的扩增成功率为93.3%，对雷公藤药材扩增及测序成功率均为100。结果表明DNA在药材中的降解度略高于基源植物。5.2 变异位点分析5.2.1 南蛇藤属各药用植物及雷公藤变异位点分析南蛇藤属12种植物的序列平均长度为228bp，变异位点多达60个，如此多的变异位点为其

31、准确区分提供了必要条件；南蛇藤基源植物的11条序列平均长度为222bp，变异位点数为0；雷公藤基源植物9条序列平均长度为223bp，包含2个单倍型，种内存在1个变异位点，各单倍型间的变异位点情况见表3。表3 南蛇藤属部分物种及雷公藤单倍型及变异信息种名ITS2单倍型种内变异位点数变异情况南蛇藤CorbiculatusJ1(11)0显柱南蛇藤CstylosusB1(4),B2(3)135bp处C-T变异皱果南蛇藤C. tonkinensisC1(6)0苦皮藤CangulatusD1(5)0粉背南蛇藤ChypoleucusE1(4)0长序南蛇藤CvaniotiiF1(4)0灯油藤Cpanicula

32、tusG1(1),G2(1),G3(1)231bp处C-T变异, 114bp处G-T变异小南蛇藤CcuneatusH1(2)0皱叶南蛇藤CrugosusK1(2)0刺苞南蛇藤CflagellarisL1(1),L2(1)43bp处T-C变异,18bp处C-A变异,57bp处A-G变异,143bp处A-T变异短梗南蛇藤CrosthornianusM1(1),M2(1)1193bp处A-G变异宽叶短梗南蛇藤Crosthornianus Loes. var.loeseneriN1(1),N2(1)1216bp处C-T变异雷公藤T.wilfordiiP1(7),P2(2)148bp处A-G变异 注:“

33、M1”等表示单倍型，“（）”内数字表示该单倍型序列条数。5.2.2 南蛇藤属种间及种内遗传距离分析南蛇藤属各物种K2P距离数据见表4，南蛇藤属内，除短梗南蛇藤、宽叶短梗南蛇藤和显柱南蛇藤的种内最大K2P距离（分别为0.0046,0.0046，0.0046）大于种间最小K2P距离（分别为0，0，0.0330），样品中的其他物种均是种内最大遗传K2P小于其与其他物种种间最小K2P距离。表4 南蛇藤属种内及南蛇藤属各物种与其它物种种间遗传距离物种名拉丁名种内K2P距离(平均)与种间其它物种K2P距离(平均)南蛇藤Corbiculatus000000.0234-0.0728(0.0508)显柱南蛇藤C

34、stylosus0.0000-0.0046(0.0022)0.0330-0.0728(0.0519)皱果南蛇藤C. tonkinensis000000.0523-0.0880(0.0675)苦皮藤Cangulatus000000.0673-0.0938(0.0770)粉背南蛇藤Chypoleucus000000.0234-0.0731(0.0449)长序南蛇藤Cvaniotii000000.0046-0.0884(0.0547)灯油藤Cpaniculatus0.0046-0.0092(0.0061)0.0426-0.0781(0.0609)小南蛇藤Ccuneatus000000.0281-0.

35、0935(0.0599)皱叶南蛇藤Crugosus000000.0046-0.0938(0.0573)刺苞南蛇藤Cflagellaris0.01860.0473-0.0882(0.0606)短梗南蛇藤Crosthornianus0.00460.0000-0.0834(0.0538)宽叶短梗南蛇藤Crosthornianus Loes. var.loeseneri0.00460.0000-0.0887(0.0547)5.2.3 南蛇藤与雷公藤遗传距离分析南蛇藤与雷公藤K2P距离数据见表5，南蛇藤、雷公藤的种内最大K2P距离（分别为0.0000,0.0046）均小于南蛇藤与雷公藤种间最小K2P距离

36、( 0.0884)。基于以上遗传距离分析南蛇藤能与同属其它药用植物以及雷公藤很好的区分开。表5 南蛇藤与雷公藤遗传距离K2P距离比较K2P距离(平均)南蛇藤种内0.0000雷公藤种内0.0000-0.0046(0.0018)南蛇藤与雷公藤种间0.0884-0.0938(0.0896)5.3 鉴定市场供应的商品药材南蛇藤与雷公藤从不同的药材市场购买南蛇藤药材15份（HB0695MT12-26）,雷公藤药材7份（HB3250MT07-13），运用改良的CTAB法获取各自的ITS2序列（HB0695MT26未能获得其ITS2）序列，将测序剪切后的ITS2序列导入NCBI鉴定（ HYPERLINK /

37、Blast.cgi/）进行初步比对鉴定，比对结果见表6 /Blast.cgi/）进行初步比对鉴定，比对结果见表6。结果表明14份南蛇藤药材样品中，共有9份比对为南蛇藤，而HB0695MT13、20比对为硬毛南蛇藤；HB0695MT18比对为苦皮藤；HB0695MT23比对为云实科云实属喙荚云实；HB0695MT24比对为雷公藤。7份雷公藤药材样品中，共2份比对为雷公藤，另有5份（HB3250MT09-13）比对为苦皮藤，比对相似度均大于99%表6 南蛇藤、雷公藤药材信息及ITS2序列比对结果药材名药材编号药材来源比对结果相似度南蛇藤HB0695MT12；16-17湖北Celastrus orb

38、iculatus99%南蛇藤HB0695MT15；21东北Celastrus orbiculatus99%南蛇藤HB0695MT14；25安徽亳州Celastrus orbiculatus99%南蛇藤HB0695MT22云南Celastrus orbiculatus99%南蛇藤HB0695MT18四川Celastrus angulatus100%南蛇藤HB0695MT19四川Celastrus orbiculatus99%南蛇藤HB0695MT13；20东北；广西Celastrusstylosus99%南蛇藤HB0695MT23东北Caesalpinia minax100%南蛇藤HB0695M

39、T24湖北Tripterygiumwilfordii100%雷公藤HB3250MT07；08安徽亳州；湖北Tripterygiumwilfordii100%雷公藤HB3250MT09-13安徽亳州；贵州Celastrus angulatus100%5.4 系统发育邻接树分析 根据序列比对结果，将市场收集的14份南蛇藤药材和7份雷公藤药材的ITS2序列与前文已获得的基原物种的ITS2序列一起构建邻接（NJ）树（见图1）。通过NJ树结果可看出，在14份南蛇藤药材样品ITS2序列中，9份与南蛇藤聚为一支,1份与雷公藤聚为一支,另外4份聚到其它支。7份雷公藤药材样品中，2份与雷公藤聚为一支，5份与苦皮

40、藤聚为一支，NJ树鉴定结果与数据库比对结果一致。图1 基于ITS2序列构建的市场收集的南蛇藤、雷公藤药材和已知基原物种邻接（NJ）树（注：Bootstrap 1000次重复，枝上仅显示自展支持率50%的数值。“”表示雷公藤基原物种样品；“*”表示南蛇藤基原物种样品；“&”表示南蛇藤药材：“+”表示雷公藤药材；其余均为基原物种样品）6 讨论本研究首次使用DNA条形码检测市场供应药材南蛇藤与雷公藤。所有的基原物种样本经过权威专家鉴定，且所有的ITS2序列真是可靠，因此我们构建了南蛇藤属以及雷公藤DNA条形码数据库用于种内和种间遗传距离分析。结果表明南蛇藤与南蛇藤属其他药用植物种间最小K2P距离大于

41、南蛇藤种内最大K2P距离，且NJ树显示南蛇藤、雷公藤各自单独聚为一支，验证了最小距离法的结论；另外，在南蛇藤同属药用植物中，除短梗南蛇藤与宽叶短梗南蛇藤，长序南蛇藤与皱叶南蛇藤外，其他物种均各自聚为一支，能很好的区分开，证明了ITS2序列作为DNA条形码的通用性，且在南蛇藤同属药用植物中有较好的鉴定能力。中药材的真伪，严重威胁着临床用药质量安全和有效，关系到中医药事业的发展，必须引起高度重视。正品药材缺乏以及药材种植的不规范性使得药材市场混乱18，中药材掺伪的问题依然严重，寻求更有效的手段解决掺伪问题十分必要。本研究从市场上随机购买15份南蛇藤药材和7份雷公藤药材，通过实验获取的ITS2序列分

42、别为14条和7条，经与数据库比对鉴定，并结合已知基原物种序列建立NJ树从而确定其真伪，结果表明，从14份南蛇藤药材ITS2序列中检测出9个正品和5个混伪品，7份雷公藤药材ITS2序列中检测出2个正品和5个伪品，并且发现南蛇藤中混有雷公藤，该方法实现了对药材市场供应的南蛇藤、雷公藤药材的快速、准确鉴定，同时证实了ITS2序列作为药材可追溯技术的可靠性。7 结论本研究基于ITS2序列进行药材南蛇藤的溯源研究，并检测市场供应的南蛇藤、雷公藤药材是否存在混伪品，结果证明，ITS2序列不仅能成功区分南蛇藤同属药用植物，还能鉴别南蛇藤与其混伪品雷公藤，且建立的南蛇藤药材ITS2可追溯技术能实现对市场供应的

43、药材南蛇藤、雷公藤的真伪判定。为南蛇藤同属药用植物以及雷公藤的鉴定提供了分子依据，保障其临床用药的安全、有效。参考文献1中国科学院植物志编辑委员会,中国植物志M.45卷第3分册.北京:科学出版社,1999.2冯卫生,郝志友,郑晓坷.南蛇藤属药用植物化学成分研究进展J.中国新药杂志,2007,16(9):672-677.3Huag HC, Shen CC, Chen CF, et al. A novel agarofuran sesquiterpene , celahin D from Celastrus hindsii BenthJ. Chemical Pharmaceutical Bulle

44、tin, 2000, 48(7):1079-1080.4 Allison AC, Cacabelos R, Lombardi RM, et al. Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatryJ. psychiatry, 2001, 25(7):1341-1357.5Bang YH, Hang SK, Jeong HL, et al. A new flavan-3-ol glucoside , (-)-epicatcehin-5-O-D-glucosyl-3-ben-zoateJ. J Nat Prod, 2001,

45、64(1):82-84.6Wang H, Tian XA, Ying GQ. A New Nortriterpene from the Root of Celastrus hypoleucusJ. Helv Chim Acta, 2010, 93(8):1628-1633.7Wang KW, Sun HX, Wu B. Two novel olean triterpenoids from Celastrus hypoleucusJ. Helv Chim Acta, 2005, 88:990-995.8Liu JK, Han XW, jia ZJ. Two sesquiterpene alkal

46、oids from Celastrus angulatusJ. Phytochemistry, 1991, 30:3437-3440.9Wu WJ, Wang MA, Zhu ZB, et al. Five new insecticidal sesquiterpenoids from Celastrus angulatusJ. J Nat Prod, 2001, 64:364-367.10Huang FC, Chan WK, Moriarty KJ. Novel cytokine release inhibitors. Part I:TriterpenesJ. Bioorg Med Chem Lett. 1998, 8(14):1883-1886.11阎克里,路平等.中药南蛇藤的研究进展J.西北药学杂志,2003,18(4):187-189. 12梁碧燕.南蛇藤生药研究