毕业论文-红花油茶种子无菌体系的建立及愈伤组织的诱导

1、南京晓庄学院2015届本科毕业论文 南京晓庄学院本科生毕业设计 红花油茶种子无菌体系的建立及愈伤组织的诱导Camellia chekiangoleosa seeds to establish a sterile environment and produce Tissue culture callus 所属院(部):食品科学学院 学生姓名： 指导教师： 研究起止日期：二一四 年 五 月至 二一五 年 三 月二一五 年 五 月学位论文独创性声明 【摘要】：通过组织培养的方法，以优良母系所产种子作为实验材料，首先建立无菌体系，实验证明用75%酒精先灭菌30s，0.1%升汞灭菌8min起到有效的灭菌

2、作用。在建立好的无菌体系上切开种子，将切面贴于培养基上，诱导愈伤组织，实验证明，利用N6+NAA1.0mg/L+6-BA 3.0mg/L+10%/L土豆汁培养基，愈伤组织长势最好，时间所用最短。【关键词】：红花油茶种子; 无菌体系; 组织培养; 愈伤组织;【Abstract】:According to the method of tissue culture callus, the experiment use good seeds from the matriarchal system of sterile as experiment material. The experiment pro

3、ves that using 75% alcohol to sterilize for 30 seconds and 0.1% Mercury(II) chloride to sterilize for 8 minutes is effective.seeds has cut open,then putting them on the medium,Seeds Cultivating callus, the experiment shows that using N6 + NAA1.0 mg/L + 6-BA3.0 mg/L + 10% / L potatoes, callus grew be

4、st with the shortest time.【Key words】:Camellia chekiangoleosa seeds; A sterile environment; Tissue culture; callus;目录 前言1 1.1 红花油茶基本情况简介1 1.2 红花油茶组织培养培养的现状1实验材料与实验方法22.1 实验植物材料22.2 培养基的配制22.3实验器材22.4 实验预处理22.5 红花油茶种子的灭菌及无菌体系的建立22.6 接种及愈伤组织的诱导32.7 实验培养条件3三、实验数据记录及描述3 3.1 光周期培养30d后，种子萌发相关数据及照片记录如下3 3.

5、2 经过60d光周期培养后，愈伤组织生长相关数据记录如下3四、实验结果总结5参考文献7致 谢8 、前言1.1 红花油茶基本情况简介油茶是现今世界四大木本油料树种之一。油茶是我国的特有树种，发展空间远超于油橄榄，在保健功能等方面，很多营养指标优于橄榄油1。红花油茶属于山茶科山茶属树种,每年开花时间在2月中旬到3月中下旬；浙江红花油茶树皮多为灰白色或淡褐色、表皮光滑，多产于浙江、福建、江西、湖南、安徽等地，一般生长于海拔5001800m山地或沟边等地区，喜好湿润酸性红黄土等环境，但生长速度比普通油茶要慢些，实生苗栽植大概需要10年的生长才能结出果实；但红花油茶具有耐干旱，耐瘠薄的地质等优势，抗病虫

6、害等特性较强。同时，花的颜色艳丽，特别适合做庭院观赏树2-3。而红花油茶籽油的品质及保健功能比一般油茶籽油更加优越。其含油量高、油品质量好、色泽透亮，含有的不饱和脂肪酸高达90%以上，远远超过普通油茶。相反，饱和脂肪酸含量却比一般油茶低的多,是家庭喜爱的上等食用油4。在以前，对油茶方面的研究很多集中在一般油茶上5，而红花油茶树种的研究却很少。目前，红花油茶在人工培育方面很少。在研究方面，生根一直是研究难点所在，现在主要用种子进行育苗，再进行扩繁。为了改进并提高林木改良过程中的优良品种，避免优良基因在快繁中分化，无性快繁是最好的技术，植物组织培养是林木繁殖的重要方式，也是优良品种推广的重要手段。

7、所以本实验利用种子愈伤组织培养技术，利用激素诱导形成具有统一优良性状的品系。1.2 红花油茶组织培养培养的现状目前，植物组织培养在快繁、脱毒、育种和种质资源保存等方面发挥了重要作用，在植物组织培养方面也发挥了不可代替的作用6。但国际上关于油茶组织培养的研究却很少。1980年，颜慕勤对油茶组织进行培养，并成功诱导出了油茶的胚状体，再对胚状体进行诱导，成功分化出完整植株7。1981年和1982年，隆振雄和卢天玲等学者先后利用油茶未成熟的子叶胚，进行离体培养，也成功获得完整植株8-9。此后，隆振雄对油茶的花药培养进行了研究，通过植物组织培养的方法，诱导出了愈伤组织，并获得了芽点和不定根，但没有分化获

8、得完整植株。随后油茶组织培养的研究停滞不前,2002-2004年，毕方铖等学者对油茶的茎段、幼胚、子叶在离体条件下进行培养，诱导并获得完整植株，揭示了油茶胚状体起源于单细胞原胚或者多细胞团，胚状体多从表皮细胞的胚性愈伤组织诱导产生，筛选出了再生丛芽、子叶形成胚性愈伤组织及其不定芽分化的最适培养基配方;还通过RAPD鉴别分析，在DNA水平上均未发现变异，说明通过组织培养建立的油茶优良无性系再生植株无变异，最终获得的组培苗木能够保持原无性系的优良特性，其遗传是稳定的，为油茶优良无性系组培扩繁和生物技术育种的再生体系建立打下了基础10。2、实验材料与实验方法2.1 实验植物材料 实验材料选自福建省武

9、夷山的浙江红花油茶。2.2 培养基的配制查阅相关文献,本实验采用N6培养基作为最基本培养基，N6培养基最主要的特点是能快熟诱导愈伤组织的形成并能刺激愈伤组织增殖。油茶生长的主要激素是NAA与6-BA这两种激素,NAA中文名萘乙酸，是一种植物生长素；6-BA中文名6-苄氨基腺嘌呤，作为一种细胞分裂素，在组织培养中的作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生，这两种激素在油茶组织培养中经常使用到。但本实验所研究的红花油茶虽然同属一科，但形态与生长习性上还是有很大差别的，不能照搬油茶组织培养的激素配方，需要通过实验来验证真正适合红花油茶生长激素的浓度范围。通过对相关文献分析，最终拟定相关激素浓度：N

10、6+NAA1.0mg/L+6-BA3.0mg/L+10%/L土豆汁；N6+NAA0.5mg/L+6-BA2.0mg/L+10%/L土豆汁；N6+NAA1.0mg/L+6-BA2.0mg/L+10%/L土豆汁；4、N6+NAA1.0mg/L+10%/L土豆汁(对照组实验)以做实验对比，记录分析数据，得出红花油茶愈伤诱导最适激素浓度，按激素浓度梯度分别配置成相应的培养基，灭菌放于无菌室中备用11-15。2.3实验器材无菌解剖刀、无菌镊子，无菌瓶、无菌水、无菌培养皿、无菌支架、酒精灯、75%酒精、0.1%升汞、瓷钵等。2.4 实验预处理先用瓷钵去掉种子外壳，力道要轻，以免伤及种子组织。清水浸泡1.5

11、h，去掉种皮，用洗涤剂清洗，并流水冲洗2h备用。2.5 红花油茶种子的灭菌及无菌体系的建立2.5.1将超净工作台用75%的酒精擦拭，开启紫外灯灭菌20min。2.5.2将流水冲洗好的种子用镊子装入无菌瓶中，倒入75%的酒精，使种子完全浸入酒精中，搅动灭菌30S，倒出酒精用无菌水冲洗1次。2.5.3倒入0.1%升汞搅动灭菌，搅动灭菌8min，倒出升汞，用无菌水冲洗4-5次。2.6 接种及愈伤组织的诱导将灭好菌的种子按粒至于无菌培养皿中，用无菌解剖刀延种子子叶缝垂直方向对半切开，并按无菌操作接种到事先配置好的不同浓度激素的培养基中，将切面贴在培养基表面进行培养，并做好相关记录。2.7 实验培养条件

12、将接种好的种子至于培养室中进行暗培养3d，控制温度在25上下浮动，相对湿度保持早40%-50%即可。3d后进行光周期培养16-20。3、实验数据记录及描述3.1 光周期培养30d后，种子萌发相关数据及照片记录如下：表1 种子萌发情况seeds germination introducing培养基接种瓶数萌发瓶数萌发率NAA1.0mg/L+6-BA6.0mg/L+10%/L土豆汁201680%NAA1.0mg/L+6-BA4.0mg/L+10%/L土豆汁201260%NAA0.5mg/L+6-BA4.0mg/L+10%/L土豆汁20945%NAA1.0mg/L+10%/L土豆汁20525% 实验

13、数据分析：通过实验数据可以看出，6-BA对于红花油茶的萌发生长具有很大的刺激效果。从数据不难看出，当6-BA浓度达到6.0mg/L时，种子萌发率达到80%，且种子萌发迹象明显，长势较快；相比而言，当培养基中不加入6-BA时，种子萌发率只有25%，种子虽有萌发，但萌发迹象不明显，长势较慢。由此说明种子随着6-BA浓度的不断提高，对于红花油茶种子的萌发的刺激也不断加强。3.2 经过60d光周期培养后，愈伤组织生长相关数据记录如下：表2 愈伤组织生长情况Seeds callus growth introducing处理6-BA(mg/L)NAA(mg/L)生长情况图16.01.0子叶周边有大量愈伤出

14、现并出现少量愈伤分化，伤口处出现大量愈伤，及出现分化现象，分化出大量胚状体，愈伤长势较好。种子胚芽开始生长，生长高度约为5CM,既有重生芽的分化及生长。图24.01.0子叶周边出现一定量的愈伤，愈伤有少量分化芽点，分化不明显；伤口处也只出现少量愈伤，愈伤长势一般，并没有明显胚状体的分化。图34.00.5子叶周边没有出现愈伤，伤口处出现少量愈伤组织，有少量愈伤组织分化，分化不明显，且分化出来的芽点发白，长势较差。图401.0子叶只是吸收水分，出现膨胀，并没有出现生长迹象，只有极少数绿色愈伤生长，无愈伤组织分化。图1 愈伤组织生长旺盛，有明显分化出现。图2 愈伤组织有明显生长，并有少量愈伤组织分化

15、。图3 有一定量的愈伤组织的出现，没有较明显的分化。图4 愈伤组织长势较差，颜色暗淡，没有分化出现。4、实验结论与分析通过本实验可以得出，在NAA浓度相同的情况下，通过调节6-BA的浓度来观察愈伤组织生长及分化情况，通过实验数据分析，当6-BA浓度不断升高后，对于种子萌发及愈伤组织的生长分化的刺激效果不断增强，当6-BA浓度达到6.0mg/L时，萌发率达到80%，有大量愈伤长出，并且愈伤有明显的分化现象；相同的种子，在缺少6-BA的情况下，萌发并长出愈伤率只达到25%，种子不仅萌发率低，且只能长出很少一部分愈伤，愈伤组织生长较为缓慢，且分化程度低，愈伤组织呈现透明状，长势较差。在6-BA浓度相

16、同的情况下，通过改变NAA的量，相同条件下观察愈伤组织的生长情况，经数据分析得到，相同6-BA的情况下，NAA浓度在1.0mg/L的条件下种子萌发率及愈伤组织生长情况比NAA浓度在0.5mg/L的条件下生长要好。当NAA的浓度为1.0mg/L的条件下，愈伤组织生长速度比较快，愈伤组织有一定程度的分化，相比之下当NAA的浓度为0.5mg/L的条件下，愈伤组织生长缓慢，分化率较低，愈伤组织明显发黄，长势较差。综上所述，通过调节激素浓度梯度，红花油茶在N6+NAA1.0mg/L+6-BA6.0mg/L+10%/L土豆汁配方的培养基中长势最为明显，且愈伤组织分化成芽程度较高，可见6-BA对于愈伤组织的

17、诱导及分化起很强的刺激作用，并且随着6-BA量的增加，刺激效果不断增强。NAA在其中也起到不可缺少的作用，当NAA的浓度从0.5mg/L增加到1.0mg/L时，愈伤组织生长刺激作用明显增强，分化程度明显提高，作用较为明显。参考文献1韩宁林,赵学民.油茶高产品种栽培M.北京:中国农业出版社,2009,.2颜慕勤.油茶体细胞胚状体的发生J.实验生物学报,1980,3(3):34-34.3庄瑞林.中国油茶M.北京:中国林业出版社,2008.4庄朱辉.油茶扦插育苗试验研究J.福建林业科技,2003,30(3):3-5.5祁承经,汤庚国.树木学M.北京:中国林业出版社,2007.6胡哲森.浙江红花油茶种

18、子油中脂肪酸的分析J.福建林学院学报,1987,7(1):69-70.7王瑞,陈永忠,油茶组织培养与植株再生研究进展J,湖南林业科技,2006(5):67-68.8隆振雄.油茶幼胚离体培养初获完整植株J.林业科技通讯,1981(1):12-16.9毕方铖，谭晓风，张智俊.油茶离体培养诱导再生植株的研究J.经济林研究,2004,22(2):5-9.10卢天玲.油茶未成熟子叶幼胚离体培养成苗的研究J.实验生物学报,1982,5(4):39-40.11王瑞,陈永忠,王湘南.油茶优良无性系叶片愈伤组织诱导研究J.经济林研究,2009，27(2):35-3912毕方诚，谭晓风，张智俊.油茶离体培养诱导再生植株的研究J.经济林研究,2004，22(2):5-913庄朱辉.油茶扦插育苗试验研究J.福建林业科技, 2003,30(3):83-85.14颜慕勤,