重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌高密度发酵

1、Recombinant Human B Lymphocyte StimulatorXue Xiao-Chang, Bao Chun-Jie, Han Wei, Qin Xin, Zhang Cun, Cao Zhu-Rong, Li Wei-Na, Zhao Yu-Hong, Zhang YingqiBiotechnology Center of Fourth Military Medical University , Xian 710032Abstrractt: Inn orrderr too reeachh thhe ggoall off hiigh celll ddenssityy fe

2、ermeentaatioon aand higgh lleveel eexprresssionn off reecommbinnantt humman B llympphoccytee sttimuulattor (E. cooli DH55/ ppKKHH-BLLyS). PPiloot ttestt off tuube cullturre aand flaask shaakinng ccultturee weere donne tto gget opttimiizedd cuultuure conndittionns, inccluddingg pHH vaaluee foor ccult

3、turee, iinduucerr coonceentrratiion of IPTTG, innducctioon ttimee annd dduraatioon, rannge of disssollvedd oxxygeen andd thhe mmannner of feeedinng. Thenn, wwe pperfformmed a thrree-timme rrepeeateed ffermmenttatiion undeer tthe esttabllishhed conndittionns. Thee fiinall ceell dennsitty wwas aboout

4、25 A6000 annd mmoree thhan 50 g oof wwet baccterria perr liiterr couuld be obttainned. Thhe aaverragee exxpreessiion levvel of reccombbinaant prooteiin wass abboutt 400% oof ttotaal bbactteriial prooteiins. Thhe rresuultss shoow tthatt thhe eestaabliisheed ffermmenttatiion proocedduree iss sttablle,

5、 of shoort cyccle andd wiith higgh eexprresssionn, wwhicch llayss thhe bbasiis ffor furrtheer ppuriificcatiion andd laargee-scaale prooducctioon oof BBLySS.Key WWordds: B LLympphoccytee Sttimuulattor, Reccombbinaant Esccherrichhia colli, Higgh ccelll deensiity ferrmenntattionn 重组人B淋淋巴细胞胞刺激因因子工程程菌高密密

6、度发酵酵薛晓畅 包包春杰 韩苇 秦鑫 张存 曹筑荣荣 李维维娜 赵赵玉红 张英起起(第四军医医大学药药学系生生物技术术中心, 西安安71000322)摘要：为为实现重重组人BB淋巴细细胞刺激激因子工工程菌EE.cooli DH55/pKKHH-BLLyS的的高密度度、高表达达发酵, 首先进进行了培培养条件件的摸索索, 确定了了该工程程菌的最最佳培养养pH值值、诱导导剂IPPTG的的浓度、诱诱导的最最佳时间间段、溶溶氧范围围以及补补料的流流加方式式等, 根据优优化条件件，用55 L自自控发酵酵罐进行行三批重复复发酵, 最终菌菌体密度度均达到到25 AA6000以上，菌菌体获得得量均可可达湿重重3

7、0 g以上上，目的的蛋白质质的表达达量占菌菌体总蛋蛋白的440%左右右，保持并并超过了了该重组组蛋白在在试管和和摇瓶中中的表达达量。此此发酵工工艺具有有周期短短、产量量高、重重复性稳稳定性好好等特点点，为下下游的纯纯化和进进一步的的大规模模生产奠奠定了基基础。关键词：BB淋巴细细胞刺激激因子; 重组大大肠杆菌菌; 高密度度发酵中图分类号号: Q5516; TQQ92 文献献标识码码:A 文章章编号：B淋巴细胞胞刺激因因子（BB Lympphoccytee Stimmulaatorr, BBLySS）是19999年年由瑞士士和美国国科学家家发现的的肿瘤坏坏死因子子（Tuumorr Neecroo

8、siss Faactoor, TNFF）家族族的一个个新成员员1。该分分子含有有2855个氨基基酸，属属于III型跨膜膜蛋白。BLyS主要由T细胞和树突状细胞等髓系来源的细胞分泌。BLyS以膜结合及可溶性两种方式存在于机体中，两者均具有生物学活性。研究表明BLyS在B细胞的存活和功能调节方面发挥着重要作用，它可以延长B细胞存活时间、促进其增殖，从而导致B细胞增生和自身免疫狼疮样变化的出现。BLyS的过度表达是发生自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、多发性硬化和类风湿性关节炎等的重要因素之一2-4。BLyS已已经成为为治疗自自身免疫疫性疾病病的有效效靶点，我们构建了人BLyS疫苗表达重组载体，动物实

9、验表明该重组疫苗对于多发性硬化和类风湿性关节炎动物模型均具有良好的保护作用5。但研究结果仅局限于实验室规模。欲真正实现其价值，必须借助于高密度发酵技术，将生产提高到工业生产的规模。本文对重组人BLyS工程菌E. coliDH5/pKKH-BLyS表达和生长的特有规律进行了初步研究，并建立了一个适用于工业化的高密度、高表达生产工艺。1 材料料和方法法1. 1 材料1. 1. 1 宿主菌菌和质粒粒宿主大肠杆杆菌E. colliDHH5 suppE444 llacUU1699 (80 laccZMM15) hssdR117 rrecAA1 eendAA1 ggyrAA96 thii-1 rellA1

10、 购自Innvittroggen公公司；原原核非融融合表达达载体ppKKHH由浙江江大学王王宪锋博博士赠送送，重组组质粒ppKKHH-BLLyS由由第四军军医大学学生物技技术中心心构建，基因的的表达受受Trcc启动子子控制，IPTTG能诱诱导目的的基因的的表达，氨苄青霉霉素抗性性。1. 1. 2 培养基基LB 培养养基用于于试管种种子培养养，2YTT培养基基用于三三角摇瓶瓶培养，半合成成培养基基用于55 L发酵酵罐中分分批补料料培养。LB 培养基基中含有有(g/L)：蛋白胨胨10，酵母粉粉5，NaCCl 10；半合成成培养基基中含有有(g/L)：磷酸盐盐适量( KHH2PO4K2HPOO4Na

11、2HPOO4122H2O =247), (NNH4) 2SOO4 1.8，NH4Cl 0.33，蛋白胨胨4.55，酵母粉粉2.225，甘油适适量和微微量元素素(MggSO44 77H2O 00.3)；补料基基质中含含有(gg/L)：甘油适适量，酵母粉粉5，蛋白胨胨10，MgSSO47HH2O 00.6。用5 mmol/ L NaOOH 溶溶液，将溶液液的pHH值全部部调为77.0。培养基基和补料料在1221高压灭灭菌200 miin，各种培培养基中中都加入入氨苄青青霉素。1. 1. 3 仪器Biosttat-CT55型5L自动动发酵罐罐，德国国B BBrowwn公司司；J22-SHH型冷冻冻高

12、速离离心机为为美国Beechmman公公司产品品；微量蛋蛋白电泳泳仪为BBio-Radd公司产产品；Ulttrasscann XLL灰度扫扫描仪为为LKBB产品。1. 2 方法法1. 2. 1 试管表表达取-70保存甘甘油菌种种，划线接接种于含含氨苄(1000 g/ml)的LB平板板，37培培养过夜夜，挑取单克隆菌菌落于5 mll LBB试管中中，37，2000 r/minn振摇培培养至AA60000.660.88，加入IPPTG诱诱导表达达，将表表达量最最高的克克隆作为为发酵用用种子，分分装冷冻冻保存，每每批发酵酵取出一一管，以以保证菌菌种的稳稳定性。未未诱导菌菌液可作作为活化化种子保保存于

13、44。1.2. 2 摇瓶培培养2%活化种种子接种种于含1150 ml 2YTT的5000 mll摇瓶中中，37，2000 r/minn振摇培培养至对对数中期期，加入IPTTG诱导导或作为为5 LL发酵罐罐的菌种种。1. 2. 3 5L自控控发酵罐罐中分批批补料培培养取三角瓶种种子液按按3%接种入入发酵罐罐。控制制参数为为溶氧及及转速：溶氧控控制在330%50%，达到最最大转速速8000 r/minn后, 自动动通入纯纯氧。温温度控制制为377。pHH值设定定为7.0，当pHH低于该该值时，通通过流加加30%的氨水来保持恒恒定。补补料流加加方案为为发酵过过程中006 hh不加补补料，68 h补料

14、料流速设设定为550 mml/ h, 810 hh补料流流速设定定为1000 mml/hh 。1. 2. 4 重组BLLyS表表达量测测定按常常规SDDS-PAGGE检测测，灰度扫扫描仪分分析重组组蛋白占占菌体总总蛋白的的百分含含量。1. 2. 5 菌体浓浓度测量量采用称重法法和浓度度法，A6000 nm吸收收值与细细胞干重重呈线性性。一个个单位的的A6000约为干干菌0. 4 g/LL。1. 2. 6 菌体总总蛋白测测定Bradffordd法测菌菌体总蛋蛋白，总平均均值为00. 5525 g/gg (蛋蛋白/干菌体体) 66。2 结果2. 1 试管管培养及及条件优优化2. 1. 1 试管培培

15、养中诱诱导表达达时间的的优化试管培养至至对数中中期(AA6000 =00.6), 加入入0.1 mmmol/ L IPTTG诱导导重组蛋蛋白的表表达，每0.55 h取取样一次次，SDSS-PAGGE分析析表达情情况。结结果表明明诱导11 h后外外源蛋白白即开始始表达，表达水水平在33 h内内迅速提提高，44 h达到高高峰，5 h后开始始下降，菌体密密度也有有所降低低。由此此确定发发酵结束束时间可可以在诱诱导后445 hh，控制在在菌体密密度开始始下降前前。 1 2 3 4 5 6Fig.11 工程程菌发酵酵的菌体体生长曲曲线和目目的蛋白白表达水水平。1: 未诱诱导菌体体总蛋白白; 22: 诱诱

16、导1小小时菌体体总蛋白白; 33: 诱诱导2小小时菌体体总蛋白白; 44: 诱诱导3小小时菌体体总蛋白白; 55: 诱诱导4小小时菌体体总蛋白白; 66: 诱诱导5小小时菌体体总蛋白白.2. 1. 2 IPTTG浓度度对重组组蛋白表表达水平平的影响响试管培养至至A6000 =00.6时时，加入IPPTG至至0. 01、0. 02、0. 055、0.1、0.2、0.5、1.0、22.0 mmool/LL终浓度度，诱导表表达4 h，最终菌菌体密度度为1.5 A6000，取样用用SDSS-PAGGE检测测。结果果可见00.011 mmmol/L IIPTGG即有诱诱导外源源蛋白表表达的能能力，在在0

17、.00122 mmmol/L时，IPTG诱导浓度对目的蛋白质的表达水平没有显著性影响。本文发酵中采用0.5 mmol/L IPTG诱导菌体浓度为25 A600左右的菌体表达，取得了良好的结果。1 22 3 4 5 6 7 8 9Fig.22 不同同浓度IIPTGG诱导剂剂对于TTT-BBLySS蛋白质质表达水水平的影影响 1: 未诱诱导菌体体总蛋白白; 22-9: 0.01、00.022、0.05、00.1、00.2、00.5、11和2 mmmoll/L IPTTG诱导导后菌体体总蛋白白.2. 2 三角角瓶培养养中诱导导时机对细菌菌生长和和蛋白表表达的影影响利用特制的的通气良良好的三三角瓶进进

18、行培养养，在细菌菌生长的的对数早早、中、晚晚期(分别培培养4 h、6 hh、8 hh)加入入0.1 mmmol/ L IPTTG进行行表达44 h，结果表表明在中中期诱导导不仅最最终菌体体密度较较高，重组蛋蛋白的产产量也较较其它各各期更高高。如在在早期诱诱导，虽虽然表达达量比较较高，但但是由于于诱导剂剂的抑制制效果收收菌量明明显下降降；在晚晚期进行行诱导，尽管诱诱导时菌菌体密度度更高，但诱导导后细菌菌生长很很快进入入衰亡期期，并有自自溶倾向向，因而表表达外源源基因的的能力也也随之下下降。2. 3 5L发酵酵罐中工工程菌的的高密度度、高表表达培养养图3显示DDH5/pKKKH-BBLySS高密度

19、度高表达达培养发发酵的在在线控制制图。整整个发酵酵过程中中pH控制制在7.0左右右，温度377，溶解氧氧35%左右，转速于于8 h左右右达到8800 r/mmin并并开始利利用纯氧氧。发酵酵开始的的06 hh，培养基基中含有有一定的的营养物物质，故不加加补料，6 hh后pH逐渐渐升高，说明培培养基中中碳源已已耗尽，细菌生生长分解解氮源，结果代代谢产生生NH4+而使pHH升高，此时是是补料的的最佳时时期，同时加加入0.5 mmmoll/ LL IPTTG，诱导表表达BLLyS后后细菌的的生长开开始逐渐渐减缓，于诱导导后4 h终止止发酵(图3)，最终菌菌体密度度为255 A6000， SDSS-P

20、AGGE(图图4)后激激光灰度度扫描得得重组蛋蛋白的表表达量约约为40%（最高高可以达达到477%）。Fig.33pKKKH-TTT-BBLySS/DHH5工程菌菌补料分分批培养养的菌体体生长曲曲线和TTT-BBLySS表达曲曲线 1 22 3 44 5 6 77 A BFig.44 TTT-BLLyS表表达水平平的SDDS-PPAGEE及灰度度扫描鉴鉴定A：1: 蛋白质质分子量量Marrkerr; 22,4,6: 未诱导导菌体总总蛋白; 3,5,77: 诱诱导后蛋蛋白表达达情况.B: 目的的蛋白质质SDSS-PAAGE分分析的灰灰度扫描描结果.3 讨论基因工程菌菌的发酵酵不同于于传统发发酵工

21、艺艺，前者带带有外源源克隆基基因的重重组表达达载体，发酵生生产的目目的是要要获得大大量的外外源基因因产物，尽可能能减少宿宿主细胞胞本身蛋蛋白的污污染。重重组大肠肠杆菌高高密度培培养受表表达系统统、培养养基、培培养方式式、发酵酵条件控控制等多多种因素素的影响响7,8，对菌体体高密度度培养的的同时实实现高表表达的研研究报道道不多。在在实际操操作中，需要对对各种因因素进行行优化，建立最最佳的发发酵工艺艺。在本研研究中，我们对对单因素素逐个优优化，最终达达到对整整个工艺艺的优化化。我们采采用建立立的中试试发酵工工艺，三批重复复试验结结果，最最终菌体体密度均均超过A 6000 nmm25，菌体获获得量均

22、均达湿质质量浓度度50 g/LL 以上上，目的蛋蛋白表达达量均高高于400%，比比试管和和摇瓶的的表达水水平略有有提高，取得了了较佳的的结果。试试管和摇摇瓶培养养条件的的摸索对对发酵的的成功很很关键，其中,碳源的选择至关重要，对于大肠杆菌，高浓度的葡萄糖将造成乙酸盐的堆积，降低工程菌产量和表达量。因此,选用甘油作为碳源较好。由于各种工程菌都有其自身的生长和表达规律，发酵的另一个重要因素就是外源蛋白最佳的诱导时机。诱导后，携带质粒的细胞生长速率显著降低，而不带质粒的细胞则不受影响。因此，提前诱导使菌体和目的蛋白的产量降低，同时也增加了染菌的机会。而诱导较晚虽可以获产量高的菌体量，但细菌已经开始老

23、化，其生长和表达外源蛋白的能力会下降，同时表达外源蛋白消耗的大量能量会促使细菌的生长进入衰亡期，很容易导致溶菌。本文通过对诱导时机的优化，使得整个发酵过程在10 h内完成，既实现了重组蛋白的高表达、高产率，同时也降低了成本。补料的流加方式直接影响着发酵的效果。分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。但是在补料流加过程中，既不能加入得过快，也不能加入得过慢。过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还

24、易引发质粒的不稳定性。有报道表明，大肠杆菌通过分批补料发酵，每升培养液最高可得到50 g干菌种，A600 nm可达125左右。在我们实验中，严格控制补料流加的速度，在有效提高菌体产量的同时提高目的蛋白表达量。高密度发酵技术能够减少培养体积,缩短生长周期,减少设备投资并强化下游分离提取,为工业化生产降低成本。本文对重组DH5/pKKH-BLyS的高密度、高表达发酵研究将可能对其它类型重组蛋白的发酵生产具有一定的借鉴作用。Referrencces: Mooree P A, Bellvedderee O, Orrr AA, eet aal. BLyyS: memmberr off thhe ttum

25、oor nnecrrosiis ffacttor fammilyy annd BB lyymphhocyyte stiimullatoorJJ. Sciiencce, 19999, 2855(54425): 2660-2263.Huntiingtton N D, HYPERLINK /entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Tomioka+R%22%5BAuthor%5D o Click to search for citations by this author. Toomiooka R

26、, HYPERLINK /entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Clavarino+C%22%5BAuthor%5D o Click to search for citations by this author. Claavarrinoo C, ett all. AA BAAFF anttagoonisst ssupppresssess exxperrimeentaal aautooimmmunee enncepphallomyyeliitiss byy taargeetinng cce

27、lll-meediaatedd annd hhumoorall immmunne rrespponssesJ. Int Immmunool, 20006, 18(10): 114733-14485.Zhangg J, Rooschhke V, Bakker K P, et al. Cuuttiing edgge: a rrolee foor BB lyymphhocyyte stiimullatoor iin ssysttemiic llupuus eerytthemmatoosussJ. J IImmuunoll, 20001, 1666(11): 6-110.Cheemma GG S, Rosschkke VV, HHi