毕业论文-芳香酰肼折叠体聚合物的构建及其跨膜输送研究

1、芳香酰肼折叠体聚合物的构建及其跨膜输送研究化学系 化学专业 指导教目录中文摘要Abstract关键词Keyword前言1.1 超分子化学1.2 生物膜1.3 膜蛋白1.4 天然小分子通道1.4.1 短杆菌肽A(Gramicidin A)1.4.2 两性霉素B(Amphotericin B)1.4.3 丙甲菌素1.5 人工合成跨膜输送体系1.5.1 人工载体1.5.2 人工跨膜通道 1.5.2.1 超分子自组装人工跨膜通道 1.5.2.2 单分子人工跨膜通道1.6 人工离子通道的表征方法-基于囊泡的荧光实验正文2.1 目标分子的设计与合成2.2 芳酰肼大环分子M-1至M-3的嵌膜能力研究2.3

2、实验部分参考文献致谢摘要：本论文主要是关于一类新型的超分子跨膜输送体系的研究介绍。从简单的超分子化学概念出发，基于组内以前的工作，我们设计并合成了一系列超分子的芳香酰肼大环体系，并进行了表征，最后还尝试对其跨膜输送效能进行了初步的尝试。关键字： 超分子化学，跨膜输送，大环，酰肼，芳香。Abstract:This dissertation is mainly about a new kind of supramolecular transmembrane system. From the ordinary conception of supermolecular chemistry, a ser

3、ies of aromatic hydrazide macrocycle molecules were designed and synthesized based on former work in our group. After proper characterization, we tried testing their tranmembrane transporting efficiency.Keywords: supermolecular chemistry , transmembrane transportation , macrocycles , hydriazide, aro

4、matic.前言1.1 超分子化学 “超分子化学”（supramolecular chemistry）一词最早出现在websters dictionary (1903) 中，早期化学家也用“分子层次之上的化学”、“非共价键的化学”和“非分子化学”等词语来描述这个领域。1978年，法国科学家Lehn首先引入了现代超分子化学的定义1。他将超分子化学定义为分子组装及分子间成键的化学。法国科学家Lehn、美国科学家Cram和Pedersen分别在分子识别、穴状化合物和冠醚方面的研究，为超分子化学的发展做出了开创性的工作，他们三人共同获得1987年诺贝尔化学奖2。2002年，Lehn又对超分子化学重新进

5、行了定义：用非共价键的方法使各组份发生分子间的作用，来发展高度复合的体系3。分子识别（molecular recognition）与自组装或自组织（self-assembly or self-organization）一直是超分子化学的两个重要研究领域。在广义上，超分子是由很多组分（一种或多种）通过自发的或者在非共价键作用的驱动下发生结合而形成具有不同于各组分功能的聚集体。这些聚集体可以是由一个分子包结（识别）另一个分子而形成的主-客体复合物，也可以是互补的组分通过自发的碰撞（自组装）而形成的高级结构。人类对于物质世界从无序到有序变化过程以及对生物细胞自组织过程的认识都使我们对这种变化过程产生

6、浓厚的兴趣，进而模拟这种过程来创造新的物质4。超分子自组装是一种或多种组分在多个非共价键的“编码”下自发地形成热力学稳定的聚集体。聚集体的结构取决于单体分子的结构，有机合成可以提供自组装的单体分子，而自组装可以产生有序结构的聚集体。自组装可分为静态和动态自组装，它是一种具有可逆性、并最终能达到平衡的过程，这样可以确保所形成的聚集体在热力学上是最稳定的，这也说明自组装体系具有自纠错能力。自组装通常在溶液中或界面上进行，这样可以使各组分自由的移动、碰撞和结合，并且各组分与体系所处环境间的相互作用也将影响自组装的结果。现阶段我们可以见到三种尺寸的组分可以发生自组装：分子水平、纳米级（胶体、纳米线和纳

7、米微球）以及宏观物质（从微米到厘米大小）5。基于自组装的理论成果，超分子化学家已经组装出各种结构的超分子6。1. 2 生物膜细胞是生命体系活动最基本的功能与结构单位。构成生物体的细胞中都有一层薄膜，细胞内外环境由这层薄膜分隔开来，从而生命活动可以获得稳定的生物环境，这层膜称为外周膜或者是细胞膜。众所周知，细胞内还有许多细胞器与亚细胞结构(例如：线粒体、叶绿体、高尔基体、溶酶体、细胞核及内质网等)，这些细胞内的细胞器或亚细胞结构同样需要膜系统来实现不同的功能，这样的膜称为内膜。所有构成细胞的外周膜与内膜统称为生物膜。生物膜在结构上有其特殊性，虽然不同的膜系统在组成成分上有一定区别，但所有膜系统都

8、是由磷脂分子、多糖及膜蛋白等多组分组装形成的超分子化学体系(Figure 1-1)7。Figure 1-1. A schematic diagram for the cell membrane构成生物膜的膜脂根据结构不同一般可分为三种类型：甘油磷脂(glycerophospholipid)、鞘脂(sphingolipid)以及胆固醇(cholesterol)。其中在生物体中占绝大多数的是甘油磷脂。一般认为，生物膜以甘油磷脂为主体骨架，鞘脂和胆固醇分散在主体骨架中，而在膜脂所形成主体骨架中还含有具有不同功能的膜蛋白8。甘油磷脂具有亲水的头基及两条疏水的尾链，因此磷脂分子自组装形成的脂双层结构的两

9、个外表面为亲水部分，而脂双层内部则为疏水部分。这样的结构形成生物膜，使得非极性小分子物质可通过自由扩散进出细胞，而极性物质(如：氨基酸、阴阳离子等)则很难通过自由扩散进出细胞，从而保证了细胞膜内外生物环境的稳定，使各种生物功能得以正常表达。传统理论认为，膜脂主要是对其内容物提供隔离保护及骨架支撑作用。普通的脂双层在没有外界力的作用下是不能渗透离子的，如钠离子、氯离子等，因为从膜亲水端开始穿过膜疏水性内部需要很大的能量9。1.3 膜蛋白分子离子等在细胞膜内外的传输是一个精确调节的生物过程。细胞维持正常的生理功能需要不断地从外界获取营养物质、同时各种生理活动代谢产生的物质也需要及时从细胞内部排除，

10、而且细胞需要维持内外渗透压等生物环境的稳定，因此在细胞膜中对应有特定的传输系统来调节细胞与环境之间的化学物质与化学信号，从而维持生命的稳定与信息的传递。通常，这些系统是由复杂的蛋白构成，也称为膜蛋白，其中占据主导地位的是通道蛋白和载体蛋白两种形态。因此在生物细胞中，阴阳离子、水、氨基酸以及糖类等具有生物活性的物质进出细胞膜都依靠具有跨膜输送能力的膜蛋白。膜蛋白起着内外通道的作用，并表现出极高的选择性与效率，在保持细胞内部正常的生理环境、生理信号的传导和活性物质的合成等方面有极其重要的作用10。在过去的几十年中，人们对跨膜蛋白的功能进行了大量的研究，对运输与选择性机制有了一定的了解，但是仍不足够

11、清楚。就目前所得出的结论来看，在细胞膜上实现这一过程主要有两种不同的机理：一类是通过被输送的物质在膜内(或膜外)与载体蛋白结合以后，载体蛋白携带者该物质运动到细胞膜的另一侧然后将物质释放释放，这类输送过程称为“载体”型输送，典型的例子是葡萄糖传递因子(GLUT 1 transporter)；另一种是膜蛋白在膜上形成的特殊“孔道”，物质经由该“孔道”出入细胞膜。与“载体”型输送相比，被输送物质是连续的通过“孔道”进出细胞膜，这一类型的输送可称为“通道”型输送，在生物体内典型的例子是钾离子通道蛋白(Figure 1-2)。Figure 1-2. A schematic diagram for th

12、e transport protein and channel protein.前面提到，由磷脂双分子层构成的细胞膜无法在无外加驱动力的条件下输送生物体系中的阴阳离子。因为在细胞膜上有大量具有特殊输送功能的膜蛋白，才使得这一过程变得高效而且专一。从生物体系中得到启发，化学家通过有机合成构筑特定结构的有机小分子来模拟通道蛋白的输送过程，这类分子能够通过携带或控制来选择性跨膜输送生物活性物质。这些研究可为物质跨膜输送的机理提供简单的模型，也有助于深入理解通道蛋白结构与功能的关系，并将为与通道蛋白相关疾病的治疗提供新的研究思路11。1.4 天然小分子通道天然的通道蛋白虽然在传输效率及选择性方面具有巨

13、大优势，但是其结构过于复杂，很难通过化学方法构筑相似结构进行模拟。同时，由于通道蛋白不能脱离生命体进行研究等原因，其在跨膜输送过程中的种种机理还并不清晰。然而与通道蛋白具有类似功能的天然小分子通道结构却简单很多(通常是一些短肽分子)，通过化学合成较容易得到结构与其类似的有机分子，并且对于天然小分子通道的研究更加全面透彻。目前，科研工作者主要以三类天然小分子通道为模板来设计人工合成的跨膜输送体系。第一类是短杆菌肽A12，第二类是制霉菌素或两性霉素B13，第三类是丙甲菌素14。下面就这三类天然小分子通道进行介绍。1. 4. 1 短杆菌肽A(Gramicidin A)Figure 1-3. A sc

14、hematic diagram for the gramicidin A.短杆菌肽A(gramicidin A)是从短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的培养物中提取出的一种线状多肽，由15个氨基酸构成，其中包括交替排列的8个L型-氨基酸和7个D-氨基酸，这一结构特点使短杆菌肽A形成-螺旋结构。由于单个短杆菌肽A形成的螺旋结构其长度不足以穿过磷脂双层膜，所以其通常以二聚体的形式组装成为跨膜离子通道(Figure 1-24)。短杆菌肽A一般作为抗生物质使用，一般认为它的抗菌机理是通过在细菌细胞膜上形成跨膜的通道，从而改变细胞膜的通透性，使某些阳离子向膜的另一侧传输，从而使细菌的新陈代谢活

15、动受到抑制而死亡。短杆菌肽A对某些革兰氏阳性菌(Gram Positive Bacteria)有较好的抗菌效果，但对人体细胞同样有上述作用，故它的临床应用受到较大限制，一般制成药膏局部外用。1. 4. 2 两性霉素B(Amphotericin B)Figure 1-4. Models of amphotericin B function in phospholipid bilayers.由于制霉菌素(Nystatin)与两性霉素B(Amphotericin B, AMB)的结构作用机制基本类似，故此处以两性霉素B为例介绍这类天然小分子通道。两性霉素B是从节状链霉(Streptomyces no

16、dosus)的代谢产物中提取的环状多烯类抗生素，它是由37个碳原子组成，含有7个共轭双键组成的刚性疏水结构和7个羟基的饱和烷基连组成的亲水的柔性结构，是一个环状内酯两亲性分子 (Figure 1-4)。两性霉素B与固醇类分子有较强的结合能力；同时，由共轭双键组成刚性疏水结构与固醇类分子间存在范德华力作用，这就使固醇类分子与两性霉素B的结合更加紧密。举例来说，两性霉素B与真菌细胞膜上的麦角固醇(Ergosterol)结合后会形成板状结构，4到12个这样的板状结构可以在细胞膜中自组装形成“桶-板”结构的跨膜通道。利用此特点，两性霉素B可以用来治疗艾滋病、移植后的深度真菌感染。1. 4. 3 丙甲菌

17、素(Alamethicin)丙甲菌素(Alamethicin)是一种从真菌(绿色木霉菌，Trichoderma viride)中提取出的一种天然线状多肽，由20个氨基酸组成。丙甲菌素采取-螺旋结构的构象，单体长度为3.4纳米，尽管长度足以穿透磷脂双层膜，但其并不以单分子的形式形成跨膜通道。目前研究者认为，丙甲菌素在磷脂双层中以3-11个单体(最常见的为8个单体)通过自组装形成“桶-板” (barrel-stave)结构(Figure 1-5)。同短杆菌肽A类似，丙甲菌素也有较好的抗菌活性，它对细菌及真菌都有抑制或杀死功效15。Figure 1-5. (a) Alamethicin; (b) -

18、helical structure; (c) barrel - stave model.1.5 人工合成跨膜输送体系如上文所述，具有跨膜输送能力的膜蛋白在维持细胞的各类正常生理功能方面具有至关重要的作用。这些膜蛋白在跨膜输送的过程中表现出极高的选择性与效率，而且在保持细胞内部正常的生理环境、生理信号的传导和活性物质的合成等方面有极其重要的作用。这些蛋白的功能失调将引起一系列重大疾病，例如：钾离子通道蛋白在细胞间的信号传导方面有重要功能，参与调节心率、神经递质释放等重要的生物功能，钾离子通道蛋白功能异常会引起癫痫等疾病。多年以来，化学家希望通过构筑人工跨膜输送体系来模拟具有跨膜输送功能的蛋白的结

19、构与功能，以期为研究物质跨膜输送机理提供简单的模型，从而为通道病的治疗提供新的研究思路。几十年来，超分子化学家们报道了多种多样的人工跨膜输送体系，按照作用方式不同可简单的分为“人工载体”与“人工跨膜通道”两类，下面我们分别介绍这两类人工跨膜输送体系。1. 5. 1 人工载体(Artificial Transporters)如前文所述，生物体系中存在以“载体”形式输送分子、离子的载体蛋白。它的输送过程可简单描述如下：被输送的物质在膜内(或膜外)与载体蛋白结合后，载体蛋白从细胞膜的一侧向另一侧运动，并且释放被输送物质。由示意图可知，该输送过程是不连续的(Figure 1-6)。科研工作者在实验中发

20、现，一些有机小分子可以与特定的离子或分子结合，该过程与生物体系中的载体蛋白结合被输送物质时类似，以此为突破口，化学家们发展了多种类型的人工离子载体。目前，人工离子载体的研究主要集中在阴离子的跨膜输送上16。Figure 1-6. A schematic diagram for artificial transporters.2008年，A. P. Davis 课题组报道了一类以甾类化合物为骨架的人工离子载体。甾类化合物骨架与磷脂双分子层的疏水环境可以很好地相容，使得此类人工传递因子可以高效的实现氯离子的跨膜输送(Figure 1-7)17。Figure 1-7. The structures

21、of steroid-based Artificial Transporters.2013年，P. A. Gale 课题组报道了一类以邻苯二胺为骨架的人工离子载体，该体系可以跨膜输送氯离子、碳酸氢根离子等阴离子。此类人工离子载体表现出非常高的输送效率(Figure 1-8)18。Figure 1-8. (a) Structures of ortho-phenylenediamine-based bisureas; (b) Molecular mechanics lowest energy structures of 5Cl- (top) and 5HCO3- (bottom) complexe

22、s.1. 5. 2 人工跨膜通道(Artificial Channels)在前文中提到，生物体系中另有一类通道蛋白以“通道”形式跨膜输送离子、分子。与载体蛋白不同，通道蛋白是在膜上形成贯通细胞膜两侧的“孔道”，由此可以实现连续输送(Figure 1-9a)。天然通道蛋白的结构复杂、难于表征，且天然通道蛋白脱离生物体系易失活，不便于研究，故在科研工作中往往选用与其功能类似，且结构简单、性质稳定的天然小分子通道。多年来，科学工作者对这类天然通道的跨膜输送机理进行了深入的研究，并以此类天然小分子通道为模型，发展了种类繁多的人工跨膜通道体系。自1982年Tabushi 课题组首次报道人工合成跨膜通道至

23、今19，关于人工合成跨膜通道的报道逐年加速增长。从形成跨膜通道的机理上分类，主要可分为如下五大类20 (Figure 1-9b)：(A)单分子模型(Unimolecular)；(B)桶-板模型(Barrel-Stave)；(C)桶-环模型(Barrel-Hoop)；(D)桶-花环模型(Barrel-Rosette)；(E)超分子胶束模型(Micellar Supramolecules)。其中，除单分子模型外，其余四种模型均是通过超分子自组装形成的多分子跨膜通道。下面我们就超分子自组装模型与单分子模型分别加以详述。Figure 1-9. (a) A schematic diagram for a

24、rtificial channels; (b) Different models of artificial channels.1.5.2.1 超分子自组装人工跨膜通道天然小分子通道基本是以超分子自组装形式形成跨膜通道，所以在人工跨膜通道体系中，基于超分子自组装的人工跨膜通道非常重要。由有机合成得到结构相对简单的单体分子，然后通过自组装形成超分子体系，这样的过程在人工组建跨膜通道的过程中是可行的。超分子自组装人工跨膜通道体系根据结合模式不同主要分为：桶-板模型、桶-环模型、桶-花环模型、超分子胶束模型。下面举例介绍一下这几类人工跨膜通道模型。桶-板模型(Barrel-Stave)：桶-板模型的

25、构成单元是一类结构简单、不可弯曲的刚性棒状分子。S. Matile 课题组发展的苯低聚物(p-oligophenyl)是最为典型的例子，通过调节这类低聚物上的芳基数目，可得到不同长度的低聚物，它们作为刚性的棒状骨架。引入多条肽链的棒状分子嵌入脂双层膜中后，肽链之间彼此可通过氢键结合在一起，而棒状分子组成类似木桶的“木板”，四个这样的“木板”通过彼此间的肽链上的氢键结合就可以形成柱状的中空通道结构(Figure 1-10) 21。 Figure 1-10. Self-assembly of artificial ion channel from p-oligophenyl rods.桶-环模型(

26、Barrel-Hoop)：桶-环模型的构成单元是环状分子，主要包括环肽以及芳酰胺大环等。J. R. Granja 课题组报道了一系列环肽分子，它们通过环与环之间的氢键作用组装形成管状结构，此类人工合成通道对阳离子有较好的选择性(Figure 1-11)22。Figure 1-11. Self-assembly of artificial ion channel from cyclic peptide.桶-花环模型(Barrel-Rosette)：桶-花环模型中的单体分子相对前两种更小。桶-花环模型通过环与环之间的弱相互作用堆积成管状结构，这与桶-环模型类似，但桶-环模型中单体是环状结构，而桶-

27、花环模型中环状结构是由更小的片段组装形成的。典型的例子是P. Talukdar 课题组报道的以甘露醇衍生物为结构单元，通过超分子自组装形成的管状结构。在此管状结构中，三或四个基本单元通过分子间氢键形成平面环状结构，环状结构之间又通过氢键结合成为管状结构(Figure 1-12)。这类人工跨膜通道在跨膜输送的过程中表现出阴离子选择性，这不同与大部分人工跨膜通道优先选择阳离子23。Figure 1-12. Mannitol-based barrel-rosette ion channel.超分子胶束模型(Micellar Supramolecules)：T. M. Fyles 课题组报道了一类两亲

28、性的小分子化合物可在脂双层中形成跨膜通道，这类两亲性分子很可能是按照超分子胶束模型在膜上形成跨膜孔穴的 (Figure 1-13)。这类通道优先选择通过阳离子。其实，不止这个分子可以形成人工跨膜通道，很多两亲性的分子都可以在脂双层上表现出通道性质24。Figure 1-13. A micellar channel formed by double-chain amphiphiles.1.5.2.2 单分子人工跨膜通道前文所提到的超分子自组装人工跨膜通道是通过结构简单的单体分子自组装形成，过程具有较强的动态可逆性和浓度依赖性，稳定性不高，因此传输过程中输送效率和选择性都不够理想。相比之下，单分子

29、人工跨膜管道是通过有机合成直接构筑可以穿透脂双层的管状分子，一个分子即可贯穿脂双层形成通道，其结构稳定性更高，不存在浓度依赖性，往往在传输过程中也就表现出更好的输送效率以及选择性。超分子自组装通道在传输过程中往往存在多种不同构象，自组装过程通过控制条件得到特定构象是难以控制的，这就成为研究超分子自组装人工通道性质的一大难点。近几十年来，化学工作者由此展开了大量工作，发展了一系列单分子人工跨膜通道，下面我们介绍几类典型的单分子人工跨膜通道。早期，G. W. Gokel 课题组为代表的科研工作者们发展一类以冠醚结构为基础的单分子人工跨膜通道(Figure 1-14)25。冠醚是超分子化学中最古老的

30、主体分子之一，其特点是可以与金属阳离子结合，不同大小的冠醚也可以结合不同的金属阳离子。超分子化学家通过柔性或者刚性的链状结构把若干个冠醚连接起来从而得到对某些金属阳离子有特殊选择性的单分子人工跨膜通道。Figure 1-14. Unimolecular synthetic ion channels with oligocrown ionophores.2005年，M. S. Gin 课题组报道了一种以环糊精为骨架的单分子人工跨膜通道26。他们在环糊精分子的一侧引入多条低聚乙醚侧链，此侧链疏水且长度足以穿过磷脂双分子层，每条侧链上靠近环糊精骨架的位置有一个胺基(Figure 1-15)。文献报道

31、这类单分子人工通道在传输过程中可以高效传输阴离子，选择性为 I- Br- Cl-。Figure 1-15. Structure of aminocyclodextrin channel.2012年，K. Kinbara 课题组报道了一种以线状分子折叠形成的单分子跨膜通道27。此分子结构分为两部分，一部分是亲水的柔性乙氧基链，另一部分为疏水的刚性1,4-双(苯乙炔基)苯片段(Figure 1-16)。在嵌膜过程中，这类线性分子片段间会产生 - 堆积作用，从而形成贯穿脂双层的孔道，孔道内径为0.53纳米。Figure 1-16. A schematic diagram for a syntheti

32、c ion channel formed by multiblock amphiphilic oligomer in lipid bilayers.我们课题组一直致力于单分子跨膜通道的研究并取得了一些成果，克服了国际上悬而未决的难点。主要的工作是以柱芳烃(柱5或柱6芳烃)为骨架。柱芳烃的结构刚性很强，且内部有足够大的空腔。柱芳烃两端也有多个易于修饰的基团位点28。在柱芳烃两端引入适当结构的侧链，可以方便的构筑具有合适长短以及两亲性的通道分子(Figure 1-17)。Figure 1-17. A schematic diagram for a synthetic ion channel for

33、med by pillar arene2011年，我们报道了第一例以柱芳烃为骨架的单分子人工跨膜通道29。由于单个柱芳烃片段的长度仅为脂双层的1/2，故研究者将两个衍生化的柱芳烃分子同过不同长度的柔性链连接起来，从而形成单分子人工跨膜通道(Figure 1-18)。进一步研究发现，此通道可以选择性的传输质子，当两柱芳烃片段中间的柔性链为4个碳时，这类人工跨膜通道拥有最佳的传输能力。还证明了这类人工跨膜通是依靠通道分子中形成的水线来传输质子。Figure 1-18. A schematic diagram for a synthetic ion channel formed by pillar

34、arene.2014年，我们报道了一类电压门控单分子人工跨膜通道30。在这类通道分子的结构中，我们在柱5在侧链上引入了精氨酸片段。由于精氨酸上的胍基的pKa为12.48，所以在在中性、酸性或碱性的环境下都是带正电荷的。多个带正电荷的侧链使得此通道分子在膜上的开关状态可通过电压调控(Figure 1-19)。Figure 1-19. (a) Structure of channels. (b) Schematic presentation for the voltage- driven channel inserting into and leaving of lipid bilayer.尽管单

35、分子通道的研究已取得一些突破，但它同样存在着问题：结构复杂，难于合成，因此其应用范围就受到了限制。由上可知，虽然人工合成跨膜通道已取得巨大进步，但是发展新的、具有高选择性以及传输效率的或者对新物种传输具有特异性效果的人工跨膜输送体系仍具有重要意义。同样，单分子人工离子通道的结构简化与功能优化同样是亟待化学工作者解决的问题。1.6 人工离子通道的表征方法-基于囊泡的荧光实验囊泡(vesicle)是由磷脂分子自组装形成的空心球状组装体，是由磷脂双分子层形成的密封结构(Figure 1-20)。囊泡具有与活体细胞相近的膜脂结构，在生物、药物等研究方向得到了非常广泛的应用。常见的囊泡类型有：多层囊泡(

36、multi-lamellar vesicles, MLVs)，尺寸大小不均一(200 nm到1 m)；小尺寸单层囊泡(small unilamellar vesicles, SUVs)，大小在30-50 nm；大尺寸单层囊泡(large unilamellar vesicles, LUVs)，尺寸在100-200 nm；以及巨型囊泡(Giant unilamellar vesicles, GUVs)，尺寸大于300 nm31。Figure 1-20. A schematic diagram for liposome.在人工跨膜输送体系中基于囊泡的荧光实验占有重要地位，这是由于囊泡的制备方法较为

37、成熟，具有高度可重复性，以普通荧光分光光度计即可测定，且具有普适性。此方法使超分子化学工作者可以简单快捷的了解人工跨膜输送体系的输送活性。通常在囊泡内部包结不同的荧光探针就能实现对不同输送物质的检测。进行基于囊泡的荧光实验前先要制备LUVs，常用冷冻-解冷冻-过膜的方法32。制备囊泡时，将荧光探针包结到囊泡内部，待囊泡制备完成后，通过透析可以除去游离在囊泡外部的荧光素，即可得到囊泡储备液。我们知道跨膜输送离子的过程中存在电荷补偿的现象，通常分为同向传递(Symport)以及异向传递(Antiport)两种方式。当跨膜输送方式为同向传递时，可直接在囊泡储备液外加入待转运的离子，依靠内外浓度差推动

38、待转运的离子进入囊泡，从而引起荧光探针荧光强度的改变；当跨膜输送方式为异向传递时，需提前在囊泡内包结一定浓度的盐溶液，以便在离子输送过程中平衡电荷(Figure 1-21a)。实验过程中，在未加入目标分子时，被输送的离子很难通过自由扩散进入囊泡内部，荧光探针的荧光强度不会明显变化，此时的荧光强度为I0；当加入人工合成输送体系后，被输送离子通过人工合成输送体系进入囊泡内部，荧光强度会发生显著变化；当一段时间后荧光强度趋于稳定时，以表面活性剂破坏囊泡，囊泡内部的荧光探针就完全暴露在外部环境中，此时的荧光强度为I。通过公式：(It-I0)/(I-I0)进行归一化处理后，即可得到相对荧光强度曲线。该曲

39、线能够反映跨膜输送体系输送能力的强弱(Figure 1-21b)31。Figure 1-21. (a) General configuration; (b) typical result, and (c) data analysis of vesicle flux experiments.基于囊泡的荧光实验操作简单，可方便考察嵌膜能力、离子输送效率等重要参数。一般在人工离子通道的研究中，通常先使用荧光实验研究目标分子的嵌膜能力等信息，然后再通过膜片钳实验对输送机理进行深层次的研究。膜片钳实验由于本论文不涉及，故不做介绍。正文2.1 目标分子的设计与合成早期的超分子芳香折叠体研究中，多使用芳香酰

40、胺类的化合物，后来又发展出了芳香酰肼结构。酰肼结构与酰胺结构相比更为刚性，成氢键中心更多，选择性更丰富，也能组成更大孔径的折叠体，因此得以迅速发展。近几年来，我们课题组发展了几种管状单分子人工跨膜通道，实现了水、离子及小分子生物活性物质(如氨基酸)的跨膜输送(Figure 2-1)28, 30, 33-35，其中包括一类以芳酰肼为骨架，成螺旋管状构象的单分子人工离子通道，通过分子内氢键其骨架螺旋结构得以稳定。Figure 2-1. Several single-molecular channels reported by our group.与曾经的以芳酰肼为骨架螺旋管状结构不同，以芳酰肼为骨

41、架的环状结构的骨架更为刚性，环状骨架所形成的内穴更为稳定。我们设计了三种具有不同芳酰肼骨架结构的环状分子(11, 12 and 13)(Figure 2-2)，它们的内穴大小有较明显的区别，我们希望借此研究内穴大小对跨膜通道性质产生的影响。在之前的报道中，我们发现在芳酰肼骨架上引入多条L-苯丙氨酸三肽侧链所形成的螺旋管状结构具有良好的嵌膜能力。所以在本工作中，我们同样在芳酰肼骨架上引入多条L-苯丙氨酸三肽侧链，以增强目标分子的嵌膜能力。Figure 2-2. Structures of compounds M-1, M-2 and M-3.2004年，Gong 课题组报道了一种简便一步合成芳酰

42、胺骨架大环36的方法。这一方法大大缩短了合成过程(Figure 2-3)。借鉴此法，我们期望发展一类新的、合成步骤简单的单分子人工离子通道。Figure 2-3. One-Step macrocyclizations mssisted by the folding and preorganization of precursor oligomers按照设计的合成路线，在合成过程中我们对个别反应的条件进行了微调，最终获得了较成熟的、产率较高的合成路线。在该合成路线中，三肽的合成参考了组内以前的路线。之后以化合物4为原料，与氯乙酰氯发生亲核取代反应获得化合物5。化合物与已有的二酚二甲酯发生双边取代

43、反应获得化合物6，化合物6发生肼解反应获得聚合物单体7。化合物7与二酰氯在DMAP做碱的条件下通过缩合反应一步成环就可得大环分子8(具体合成步骤见实验部分)(Figure 2-4)。Figure 2-4. Synthetic protocols for 8.同以上反应类似，通过化合物7与间苯二甲酰氯之间的一步成环反应可得大环分子9。通过化合物7与萘二酰氯之间的一步成环反应可得大环分子10。将环状分子8、9及10芳酰肼骨架上L-苯丙氨酸三肽侧链端基的叔丁酯基水解为羧基即得目标分子M-1、M-2以及M-3(Figure 2-5)。Figure 2-5. Synthetic protocols fo

44、r M-1, M-2 and M-3.得到目标分子M-1至M-3后，我们通过1H NMR对目标分子结构进行了研究，并结合组内已有数据，表征结果均与目标分子结构相符合。具体数据见文末实验部分。2.2 芳酰肼大环分子M-1至M-3的嵌膜能力研究在确证了环状分子M-1至M-3的结构以后，我们进一步研究了它们的跨膜输送性质，主要是跨膜输送质子荧光实验37，看此类分子能否嵌入磷脂双层并实现质子的跨膜输送。我们在囊泡内部包结荧光探针HPTS(8-hydroxypyrene-1,3,6- trisulfonate, 0.1 mM)。HPTS对pH非常敏感，pH发生微扰，探针荧光强度就会发生明显变化，由此判断

45、大环分子的嵌膜能力。实验过程如下：以卵磷脂(EYPC)制备囊泡(LUVs)，控制囊泡内部环境为pH=7.2。在荧光比色皿中加入100 L的囊泡储备液和2 mL pH=6.0的磷酸盐缓冲液。此时，荧光比色皿中囊泡内外环境的pH不同，囊泡外部质子浓度较高，质子很难通过自由扩散穿过脂双层进入囊泡，因此探针荧光强度不会有明显变化（如图所示DMSO空白实验，Figure 3-7)。当在装有同样量囊泡储备液和缓冲液的荧光比色皿中加入环状分子M-1至M-3(0.03%, molar ratio relative to lipid, represented by x)后，我们发现HPTS荧光强度发生明显的猝灭

46、。数据经归一化处理后发现，HPTS的相对荧光强度均有明显上升，在8分钟内分别达到了81%、77%和57%(Figure 3-7)。此实验证明环状分子M-1至M-3具有良好的嵌膜能力，可以加快质子通过脂双层的速率。Figure 2-6. Changes in fluorescent intensity of HPTS (ex = 460 nm, em = 510 nm) in vesicles with time after addition of M-1, M-2 and M-3 (x = 0.03%).2.3 实验部分实验中用到的试剂均购自百灵威科技有限公司(J&K)、Alfa Aesar、

47、Sigma-Aldrich以及国药集团化学试剂有限公司等化学试剂公司；实验中所用到的溶剂均购自上海莱盈化工有限公司和国药集团化学试剂有限公司；所有无水溶剂均购自Acros。以上所有试剂如未特别说明，均直接使用。1H NMR实验使用Varain Mercury plus 400型核磁共振仪测定(298K)；荧光光谱数据使用CARY ECLIPSE 荧光分光光度计测得。化合物5的合成称取2.0g三肽加入烘干的三颈瓶并连接带气球的三通和恒压滴液漏斗，并置换氮气。向三颈瓶中加入15mL无水DCM，向恒压滴液漏斗中加入5mL。将反应体系放入冰浴中搅拌，待冷却后，向三颈瓶中加入三乙胺1.89mL，再向恒压

48、滴液漏斗中加入氯乙酰氯0.73mL。打开滴液漏斗旋钮向反应体系中滴加氯乙酰氯，控制在20分钟左右滴完。以TLC监测反应。反应完成后将三颈瓶中的不溶物捣碎，并加入DCM稀释，然后转移至分液漏斗中，先用饱和氯化钠溶液洗3次，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗两次，再用饱和氯化钠溶液洗3次，有机相经无水硫酸钠干燥后旋干得粗产品，后经柱层析分离得纯品2.057g，收率89%。Yellow solid. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 7.29-7.15 (m, 10H), 7.08-7.03 (m, 5H), 6.46 (d, J = 7.2 Hz,1H), 6.32 (d, J = 7.6

49、Hz, 1H), 4.63-4.56 (m, 3H), 3.89 (q, J = 15.2 Hz, 2H), 3.05-2.96 (m, 6H), 1.38 (s, 9H).Figure 2-7. 1H NMR spectrum of 5 in CDCl3.化合物6的合成称取二酚二甲酯(0.68 g, 3.0 mmol)、5(5.33 g, 9.0 mmol)、碳酸钾(2.49 g, 18 mmol)以及碘化钾(0.25 g, 1.5 mmol)加入到烘干的三颈瓶中，加入100mL乙腈溶解。在三颈瓶上连接回流冷凝管并接上带气球三通，置换氮气后移入60度油浴反应。TLC监测反应结束后，停止加热，

50、旋干溶剂，使用水/DCM体系萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥后旋干。柱层析得白色固体，收率95%。Yield: 95%. 1H NMR (CDCl3): 8.69 (s, 1 H), 8.43 (d, J = 8 Hz, 2 H), 7.24-6.99 (m, 30 H), 6.86 (s, 1 H), 6.60 (d, J = 8 Hz, 1 H), 6.37 (s, 1 H), 6.31(d, J = 8 Hz, 2 H), 4.8 (m, 2 H), 4.66-4.58 (m, 4 H), 4.36 (m, 4 H), 3.95 (s, 6 H), 3.21 (d, J = 4 Hz,

51、 1 H), 3.18 (d, J = 4 Hz, 1 H), 3.10-2.92 (m, 10 H), 1.34 (s, 18 H).Figure 2-8. 1H NMR spectrum of 6 in CDCl3.化合物7的合成称取6(1.34 g, 1.0 mmol)溶于EtOH/THF(20/30 mL)的混合溶剂中。加入水合肼(85%, 9.7 mL, 200 mmol)后置换氮气，置于油浴50度反应24小时。反应有白色絮状物产生。TLC监测反应完成后，移除油浴静置，抽滤，水洗，得白色固体。Yield: 45%. 1H NMR (DMSO-d6): 9.61 (s, 2 H), 8

52、.52-8.48 (m, 4 H), 8.32 (d, J = 8 Hz, 2H), 8.16 (s, 1 H), 7.28-7.03 (m, 30 H), 6.26 (s, 1 H), 4.61-4.56(m, 6 H), 4.42-4.37 (m, 8 H), 3.04-2.96 (m, 8 H), 2.82-2.65 (m, 4 H), 1.30 (s, 18 H).Figure 2-9. 1H NMR spectrum of 7 in DMSO-d6.化合物8的合成取烘干的50ml具支烧瓶，取出后密封并无水无氧处理，加入2-甲氧基异酞酸(2-Methoxyisophthalic aci

53、d)(1eq), 置换氮气后，加入无水DCM，并加入1滴DMF，搅拌，取草酰氯(8eq)加入反应体系，室温搅拌2-3小时，抽干溶剂，制得二酰氯备用。从干燥箱中取出50ml具支烧瓶，并做无水无氧处理，加入7(0.67 g, 0.5 mmol)、DMAP(122mg, 1.0 mmol), 置换氮气后，加入无水二氯甲烷(20 mL)，并于冰盐浴中搅拌。随后取间苯二酰氯(0.12 g, 0.50 mmol)溶于无水二氯甲烷(10 mL)中，将此溶液在冰盐浴下逐滴加至含有化合物7的反应瓶中，加入完毕后维持冰盐浴2小时。待反应体系自然回至室温后，移入油浴回流反应24小时。反应结束后，旋干溶剂后，固体残渣

54、重新溶于二氯甲烷中(50 mL)，并用稀盐酸洗(0.5 M, 50 mL)、水洗(50 mL)，最后用饱和食盐水洗(50 mL)。所得有机相经无水硫酸钠干燥后旋干。柱层析得化合物8，白色固体 (0.47 g, 63%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 10.45-10.39 (m, 10H), 8.51-8.33 (m, 20H), 7.74-7.70 (m, 6H), 7.22- 7.07 (m, 96H), 6.33-6.29 (m, 3H), 4.68-4.34(m, 30H), 4.01 (s, 6H), 3.9 (s, 3H), 3.04-2.96 (m, 24

55、H), 2.80-2.67 (m, 12H), 1.28 (s, 54H).Figure 2-10. 1H NMR spectrum of 8 in DMSO-d6.化合物9的合成化合物9由化合物7和间苯二甲酰氯反应制得，具体实验步骤参见化合物8。白色固体，收率51%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 10.80 (s, 5H), 10.38 (s, 5H), 8.55-8.14 (m, 29H), 7.66-7.64 (m, 3H), 7.22-7.07 (m, 93H), 6.25 (br, 3H), 4.65-4.33(m, 30H), 3.02-2.94 (m, 2

56、4H), 2.75-2.67 (m, 12H), 1.27 (s, 54H).Figure 2-11. 1H NMR spectrum of 9 in DMSO-d6.化合物10的合成化合物10由化合物7和化合物萘二酰氯反应制得，具体实验步骤参见化合物8。白色固体，收率59%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 10.93 (s, 5H), 10.44 (s, 5H), 8.68-8.14 (m, 41H), 7.20-7.07 (m, 90H), 6.35 (br, 3H), 4.66-4.34(m, 30H), 2.99-2.94 (br, 24H), 2.74 (br,

57、12H), 1.26 (s, 54H).Figure 2-12. 1H NMR spectrum of 10 in DMSO-d6.化合物M-1的合成在烘干的圆底烧瓶中加入11(90 mg, 0.020 mmol)，DCM(10 mL)，TFA(1 mL)。室温搅拌24小时。反应结束后减压除去溶剂，固体残渣用乙醚反复抽滤洗涤，最后用乙醇重结晶得到浅黄色固体(73 mg, 88%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.81 (s, 6H), 10.46-10.41 (m, 10H), 8.54-8.33 (m, 20H), 7.73-7.67 (m, 6H), 7.22-

58、7.07 (m, 96H), 6.31-6.27 (br, 3H), 4.65-4.31(m, 30H), 4.01 (s, 6H), 3.90 (s, 3H), 3.08-2.89 (m, 24H), 2.77-2.67 (m, 12H).Figure 2-13. 1H NMR spectrum of M-1 in DMSO-d6.化合物M-2的合成化合物M-2由化合物12合成，其合成步骤参照化合物M-1。浅黄色固体，收率84%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.80 (br, 6H), 10.80 (s, 5H), 10.38 (s, 5H), 8.56-8.14

59、 (m, 29H), 7.66-7.65 (m, 3H), 7.21-7.05 (m, 93H), 6.25 (br, 3H), 4.65-4.33(m, 30H), 3.07-2.91 (m, 24H), 2.76-2.71 (m, 12H).Figure 2-14. 1H NMR spectrum of M-2 in DMSO-d6.化合物M-3的合成化合物M-3由化合物13合成，其合成步骤参照化合物M-1。浅黄色固体，收率91%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.78 (br, 6H), 10.91 (s, 5H), 10.44 (s, 5H), 8.68-8.

60、15 (m, 41H), 7.21-7.07 (m, 90H), 6.35 (br, 3H), 4.66-4.36(m, 30H), 3.03-2.92 (m, 24H), 2.74 (br, 12H).Figure 2-15. 1H NMR spectrum of M-3 in DMSO-d6.参考文献1 Lehn, J. M. Pure Appl. Chem. 1978, 50, 871.2 Nobel Lecture: a) Lehn, J. M. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1988, 27, 89. b) Cram, D. J. Angew. Chem.