体外血小板流动腔研究方法的建立和应用

1、体外血小板流动腔研究方法的建立和应用thedevelpentandappliatinfaflhaberfrplateletresearhdepartentfbiengineering，beihanguniversity，beijing，100083，hina血小板外表膜糖蛋白glyprtein，gpib与受损血管内皮外表血管性假性血友病因子vnillebrandfatr，vf的结合是血小板血栓形成的起始步骤。这一结合使得血小板与血管内皮外表发生瞬时的结合，并以滚动的方式黏着于血管内皮外表，与此同时，启动血小板内一系列的细胞信号传导途径，发生a2+浓度增加，pi3k活化等反响1，使得血小板外表整

2、合素b3活化2。b3与vf和血浆中纤维蛋白原结合，最终使得血小板结实附着于血管外表，并互相聚集成团，形成血栓。可见，gpib与vf的结合在血小板血栓形成中起着起始、关键的作用。这一过程的研究对预防和治疗血栓形成性疾病有着重要价值。血小板和vf的互相作用通常的研究方法有：使用血小板聚集仪检测瑞斯托霉素ristetin诱导的血小板聚集；流式细胞仪技术或elisa直接检测血小板和vf的结合等。但这些方法很难反映体内血管流动条件下血小板与血管内皮的直接互相作用的实时情况。在本研究中，我们将vf包被于细玻璃管外表以模拟血管受损的情况，同时分别使用负压装置、蠕动泵和恒定注射泵以产生不同流态和准确剪切率的流

3、体环境，成功地建立了体外流体条件下血小板与vf互相作用的流体模型，为血小板相关的根底研究，以及抗血小板相关的抗血栓药物研究，提供了一种实在有效的研究方法。1材料和方法1.1试剂和仪器1.2实验方法1.3流动腔实验把包被了vf的玻璃管装在倒置显微镜上，分别使用负压装置、蠕动泵、恒定注射泵3种动力系统，根据公式r=4qr3准确计算玻璃管中的剪切率4，使得血小板或h细胞悬液通过玻璃管。流动起始后，显微录像系统显示并记录玻璃管中的情况。最后用difiedtyrdesbuffer在同样剪切率调节下冲洗玻璃管5in，仍然黏附的细胞即为激活了整合素b3的稳定黏附。2结果血小板血栓的形成与血管中的血流情况亲密

4、相关5。病理性剪切力能诱导血小板的黏附、聚集6。有研究者采用平板流动腔和锥板黏度计来模拟体内血液流动。我们采用细玻璃管简单而直观的观察到流动条件下血小板与vf结合的全过程示意图见图1。gpb与vf的互相作用使得血小板在vf外表以滚动的方式发生瞬时的黏附，同时启动血小板内一系列细胞信号转导途径，最终激活整合素b3导致血小板发生稳定的黏附。图1实验系统示意图把包被了vf的玻璃管装在倒置显微镜上，通过硅胶管连接到提供动力装置，样品分别在负压装置、蠕动泵、恒定注射泵的带动下流经玻璃管，在流出口搜集样品。同时通过d系统将图像传输到计算机，同步显示并录像。3讨论血小板发挥止血功能和产生血栓需要血小板黏着到

5、内皮下基质，而这一过程是由血小板膜糖蛋白ib与vf互相作用所起始的。gpb与vf的结合诱导一系列的细胞内信号传导使得黏附的血小板被激活：a2+浓度的改变，蛋白激酶、pi3k、蛋白磷酸化酶和酪氨酸激酶等的活化，并发生血小板肌动蛋白的重新排列8，活化整合素iib3介导更稳定的黏附，致密颗粒释放出内容物诱导血小板聚集。gpb与vf的结合是血小板发挥其功能的关键步骤。我们所建立的方法可观察和记录特定剪切率条件下，血小板或转染细胞发生黏附的过程。与通常使用的平行平板流动腔和锥板黏度计相比，我们的方法有以下几个优点：1装配简单，剪切力不会因为装配的误差而产生影响。平行平板流动腔提供的剪切力与上下平板间间隔

6、 的平方成反比，装配时的误差会对计算剪切力带来较大的影响。而锥板黏度计的锥尖由于长期使用会产生磨损，改变了锥体与平板间原有的角度，这样所产生的剪切力将不再是一致的。我们的方法不存在装配误差对剪切力的影响。2样品使用量小，节约了样本。3便于观察。由于玻璃管是透明的，我们在光学显微镜下就能清楚地观察到血小板悬液流动和黏附的情况。我们的系统也可以对血小板或细胞进展荧光染色观察。而目前还没有商品化的可视化的锥板黏度计，需要实验室自己加工。4外表处理简单。当我们研究剪切力对血小板直接作用的机制时，必须消除血小板外表同实验系统间的互相作用。使用锥板黏度计时通常采用硅油或其它非血栓形成材料外表来消除这些互相作用。而使用玻璃管只需要采用bsa封闭就可以到达要求，操作简单又方便。我们的方法也存在一些缺点。当负压系统提供动力时，是由于虹吸原理把细胞悬液吸入到玻璃管中，可在此过程中，水柱的液面高度差逐渐缩小，使得流速缓慢地发生改变。蠕动泵是在流动腔技术中广泛采用的，但是产生的是正弦流动，这与我们希望的稳定恒流不同。注射泵流速稳定，但不能建立循环的流动系统，由于血小板黏附反响时间较短，所以使用注射泵完全可以满足要求。本系统除了可以研