HPLC-DAD测定5种苯类化合物实验报告

1、HPLC-DAD测定 5 种苯类化合物（实验报告）环境工程 刘鹏 123351一、实验目的12基本了解高效液相色谱（1200LC）组成结构，硬件操作及掌握化学工作站的开机，关机，参数设定，数据采集及分析的基本操作。34掌握高效液相色谱定性、外标定量方法。二、实验原理分配色谱原理：主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。C18 柱反相 HPLC（reversed phase HPLC其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。diode-ar

2、ray detector, ）工作原理：以光电二极管阵列（或CCD 阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的 UV-VIS 检测器，它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与普通UV-VIS检测器不同的是，普通 UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列 UV-VIS 检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然Agilent 1200 DAD 全扫描波长范围为190nm-950nm ）Agilent 1200 LC 液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相

3、以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因处理或保存。外标法定量：外标法是色谱分析中一种简便的定量方法。当样品中所有组分都得到良好的分离并都能被检测而得到色谱峰时，则可利用外标法定量计算样品中各组分的浓度。其定量的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。数据处理软件（工作站）可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。一般由被测物所配标准浓度与峰面积做标准曲线，由标准曲线求出被测物浓度。三、仪器及试剂1、仪器：Agilent 1200 HPLC（四元泵、自动进样器、柱温箱、 DAD检测器、C18色

4、谱柱，稳压电源。2、试剂： 色谱级乙腈、甲醇；Miniport超纯水；含5个苯类化合物的标准品；实际测试水样四、实验方法1.进样器洗针进样2.设置泵进样量 20.0L流速 1.5ml/l溶剂停留时间 7.0minH2O 20%后运行时间 2.0min 甲醇 80%时间表时间0.0%C801.0801.017.00100.0100.03.柱温箱温控C4DAD信号4五、实验步骤5.1上机准备根据待测物要求配制 5 个浓度点标准样品，待测水样 1-2查阅文献，获得目标分析物质或相近物质的液相色谱分离条件。检查线路是否连接完好。检查流动相、洗针液是否充足，不足则根据要求添加。有机流动相必须为进口 HP

5、LC 级，水相可使用 Millipore 纯水机出水或娃哈哈屈臣氏纯净水。所有流动相在使用前均需用 0.2 m ,相需每天更换以保持新鲜。标样和样品在使用前必须用 0.2 m 的针头式滤器（进口非分装）过滤。用于清洗进样系统及管路。（其中有下划线部分为实验课程中未涉及部分）5.2 开机1打开稳压电源（指针指示 220V Accela AS、Accela PDA、Accela Pump电源开关。2打开电脑，双击工作软件Xcalibur，在status 状态栏下看到 ASPDAPump 三项显示 readyto download；仪器面板灯除Pump 部分的 RUN 灯呈橙色外，其余灯均为绿色，表

6、明仪器及通讯正常，可进行下一步操作。3purge Accela Pump purge purge Accela pump 中的 purge Roadmap中 Instrument Setup 图标，显示 Instrument Setup 界面，点击左侧仪器图标中的 Accela Pump，点击下拉主菜单中 Accela Pump 栏中的 direct control 跳出该界面；在“take pump under control”栏打勾，输入 flow 为 600 l/min100%play 键开始 10min 左右可按停止键；同样的方法可 purge 其它流动相通道，直至管路中没有气泡。Pu

7、rge 完后将 purge 阀顺时针拧到右边，取下针筒中的废液倒入指定的废液桶。4检查 Accela AS 门上自动进样针筒上部黄色密封圈上端是否有气泡，如有气泡则要先行排气，方法如下：点击软件双击 Roadmap 中 Instrument Setup 图标，显示 Instrument Setup 界面，点击左侧仪器图标中的 Accela As，点击下拉主菜单中 Accela As 栏中的 direct control 跳出该界面；选择 Flush，点击 apply（注意此时要关上 AS 5 稳定泵系统。双击软件Roadmap 中 Instrument Setup 图标，显示Instrumen

8、t Setup 左侧仪器图标中的 Accela Pump，点击下拉主菜单中 Accela Pump 栏中的 direct control 跳出该界面；take pump under control”栏打勾，输入所需流动相启动泵系统，运行20min 后方可进行其它操作（如运行 sequence5.3建立打开 UPLC 工作站 Xcalibur，双击 Roadmap 界面中的 Instrument Setup 图标，点击 Accela AS、Accela PDA、Accela Pump 图标分别设置参数。Accela AS 参数设置：除 Injection （可设为 1-20l）外，其余参数请不要

9、更改。Accela PDA 参数设置：根据样品实际情况对 run lengthtime、spectra、channels 等进行设置。Accela Pump 参数设置：选择 Gradient Program 界面，编辑流动相梯度（注意正确选择通道，以免气泡进入系统）参数设置完后保存方法（默认路径为：d:UPLCmethod5.4建立sequence点击 sequence view 图标进入 sequence 编辑界面。对于已建分析方法的样品，可直接在原来的sequence sequence Unknown InstMeth 和 ProcMethod（如没有工作曲线时可先不填此项）输入方法名及定

10、量分析方法，输入分析样品在 Accela As 中的位置以及进样量，以此类推编辑整个序列，遍及完后保存序列，并点击按钮运行。5.5 样品分析点击按钮 real time plot play 可以看到实时采集的数据。开启仪器半小时左右，可观察到仪器信号基线平稳。sequence 设置完毕后，点击 run sequence 在做标样时，标样也先作为未知样品分析，待所有样品分析完后再进行定量分析。5.6 分析结束进样系统清洗：以不含营养盐的流动相为样品（最后一个样品）run2-3 次，清洗进样系统。其它添加物）流动相洗柱, 至无明显出峰为止。最后用 80%以上的有机溶剂保存柱子。关闭工作站窗口，退出

11、工作站；关闭仪器面板 Accela AS、Accela PDA、Accela Pump 电源开关；关闭电脑，关闭稳压电源。取出样品瓶，清洁桌面，在仪器使用记录本上登记。5.7 数据处理定量分析过程（建立工作曲线）参考“Xcalibur 定量分析”说明书。未知样品结果分析，打开 sequence 在 Pro Meth 中输入定量分析方法。选择需计算浓度的样品，点击 Batch Reprocess Setup，选择 Quan 栏，Peakdetection&Intergration以及 Quantitation（注意其余选 OK。点击 Roadmap 进入 Quan Browser，打开seque

12、nce 文件名，选择显示所有数据，点击unknows 查看样品结果。六、数据处理1）原始数据实验所得色谱图 .2353025201510018.2.2776.3.1.1500标准样品数据1234min浓度（ppm） 24681019.00134.87348.61467.40678.42535.83146.58255.39265.73582.24112.85825.61835.36748.67759.04218.94137.71353.90473.33989.48266.836（2）数据处理根据标准样品的实验数据，做出峰面积随浓度变化的标准曲线。邻苯二甲酸二甲酯100峰0246812浓度1008

13、0y = 5.5987x + 23.564R2 = 0.9853峰02468121212浓度y = 5.7714x + 1.6843R2 = 0.998102468浓度10080y = 8.8354x + 1.6634R2 = 0.9992峰02468浓度y = 6.6384x + 0.6416R2= 0.9985积面峰0246812浓度根据标准曲线，计算实际单标中的物质浓度 峰面积浓度七、思考题67.4068.34465.7357.53248.6778.14273.3398.11254.6808.1401、为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。堵塞。和活塞的磨损。2、流动相使用前为什么要脱气？流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如 O2相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用 ，可能会造成荧光猝灭。3、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？冲液（PH=4-7A：请严格执行溶剂过滤。：请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液C：如果应用许可，可在溶剂中加入 0.0001-0.