分子生物学与生物化学实验操作设计与技能(7-2)课件

1、分子生物学与生物化学实验操作、设计与技能 几种重要的PCR技术(一) 李刚 副教授几种重要的PCR技术差异显示PCR3RTPCR；1出错PCR（致突变PCR）45RACE和3RACE PCR；2OEPCR5RT-PCR概述（1）RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。RT-PCR概述（2）首先经反转录酶

2、的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。常见的三种反转录酶特性1、鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV）与鼠白血病病毒勒尼株（MoMLV）来源的中温酶。AMV来源的反转录酶具有高活

3、性的RNase H,这种高活性RNase H趋向于抑制cDNA的产生限制其合成长度。MoMLV来源的反转录酶更适合RTPCR，因为它的RNase H活性较弱。但它催化反应的最适温度为37度，较AMV反转录酶的42度为低，因而对于具有高度二级结构的RNA模板可能会带来稍微不利的影响。2、缺乏RNase H活性的MoMLV反转录酶的突变体。这些酶较野生型酶对模板RNA分子的转录效率更高，合成cDNA分子的长度更长。此外，还能在更高温度下合成cDNA（高达50度），这对于容易折叠成二级结构的RNA模板更为有利。3、嗜热热稳定Tth DNA聚合酶，这种酶在RTPCR中的主要优点：它能在反转录与扩增两个

4、阶段均起作用，实验在同一个反应管内进行。但这种酶功不抵过，一方面这种酶合成的cDNA平均长度仅为12kb,它短于MoMLV反转录合成的cDNA长度（约10kb）；此外，Mn2的存在会造成DNA合成的低保真度也是令人担心的地方。最后，该酶不能用Oligo(dT)或随机六核苷酸作为引物，因为它的催化反应的最适温度下这两种引物不能与RNA模板形成稳定的杂合体。RTPCR的原理RT-PCR是一种从细胞RNA（mRNA）中高效灵敏地扩增cDNA序列的方法，它由两大步骤组成：一步是反转录（RT），另一步是PCR。反转录的起始材料可以用总RNA，也可以用mRNA。 首先，在反转录酶作用下将RNA（mRNA）

5、反转录成cDNA第一链，即以oligo(dT)、随机六寡核苷酸或基因特异序列为引物与mRNA杂交，然后由RNA依赖的DNA聚合酶（反转录酶）催化合成相应互补的cDNA链。以该cDNA第一链为模板，即可进行PCR扩增。根据靶基因设计用于PCR扩增的基因特异的上下游引物，基因特异的上游引物与cDNA第一链退火，在Taq DNA聚合酶作用下合成cDNA第二链。再以cDNA第一链和第二链为模板，用基因特异的上下游引物PCR扩增获得大量的cDNA。 RT-PCR原理示意图 一步法和两步法的比较一步法与两步法的最大区别在于RT和PCR在同一个管子中进行。与两步法相比，一步扩增法不仅简单、有效，简化了整个R

6、T-PCR的步骤，并且最大程度上避免了样品的污染。此外，一步法在检测低丰度mRNA的表达时比常规RT-PCR更具优势，一步RT-PCR法可从少至10pg总RNA中检测出基因的表达。但当分析很多基因在少量不同RNA样品表达时，两步法也不失为一种较好的方法。此外，在避免样品污染的情况下，两步法的扩增效果经常要比一步法好。 一步法操作步骤（1）（以TaKaRa公司TaKaRa One Step RNA PCR Kit为例）1、按下列组成配制RTPCR反应液。10One step RNA PCR buffer 5lMgCl2 (25 mM) 10 ldNTP Mixture (各10mM) 5 lRN

7、ase inhibitor (40 U/ l) 1 lAMV RTase XL (5 U/ l) 1 lAMV-optimized Taq (5 U/ l) 1 l上游特异性引物（20 M） 1 l下游特异性引物（20 M） 1 lPositive Control RNA或实验样品（1 g total RNA）* 1 lRNase Free dH2O 24 lTotal 50 l/sample*当目的RNA的表达量较少时，可加至25 ，同时在反应体系中相应地减少水的量。一步法操作步骤（2）（以TaKaRa公司TaKaRa One Step RNA PCR Kit为例）按以下条件进行RTPCR反

8、应：50 C 30 min RT反应94 C 2 min RTase失活94 C 30 sec37-65 C 30 sec PCR反应2530cycles72 C 1-10 min两步法操作步骤（1）（以TaKaRa公司TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver. 3.0为例）A 反转录反应合成cDNA引物可结合实际情况从Oligo dT、随机性引物或特异性引物中任选一种。1、按下列组成配制反转录反应液。10 RNA PCR buffer 1lMgCl2 (25mM) 2 ldNTP Mixture (各10mM) 1 lRNase inhibitor (40 U/ l) 0.5 l

9、AMV Reverse transcriptase 1 l下游特异性引物（20 M） 0.5 lPositive Control RNA或实验样品（500 ng total RNA） 1 lRNase Free dH2O 3.75 lTotal 10 l/sanple此反应体系已添加足够dNTP,PCR反应时不需要再添加dNTP。两步法操作步骤（2）（以TaKaRa公司TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver. 3.0为例）按以下条件进行反转录反应：4255C 1530 min RT反应99C 5 min RTase失活5 C 5 minRTPCR产品推荐1、TaKaRa公司系列产

10、品；2、Promega公司系列产品；RT-PCR操作视频RNA提取和RT-PCR实验.flvRT-PCR的几点注意事项RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。一步RT-PCR和两步RT-PCR方法哪个更好？一步RT-PCR的最大优点是操作简单，因此可避免样品间的交叉污染。但我们的实践经验表明，在大多数情况下，应首先考虑两步R

11、T-PCR方，而不是一步RT-PCR，因为两步RT-PCR产物的产量一般高于一步RT-PCR；此外两步法具有更大的灵活性，可以分别优化RT和PCR两步反应，而无需考虑它们之间的干扰。RT-PCR的引物设计1）RT-PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?答：必须知道。在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？RT-PCR以总DNA作为模板还是以mRNA作为模板好？

12、提取总RNA还是mRNA取决于实验目的。一般情况下（如克隆基因或比较不同样品间基因表达水平时），提取总RNA即可作为RT-PCR的模板。这样可以减少获得cDNA的实验步骤，从而减少实验误差。另外，分离总RNA要比分离mRNA少用一些试剂，因此更经济。但是若要构建cDNA文库，则需要分离mRNA作为模板，以便提高cDNA文库的质量。如何防止提取RNA过程中RNA的降解？主要注意以下几点：实验过程中使用的玻璃器皿使用前可于180 C干烤8小时以上，塑料制品要用氯仿冲洗。焦磷酸二乙酯（DEPC）是RNase酶的强烈抑制剂，RNA提取过程和反转录过程中所用的水要用DEPC处理。操作人员的手是RNase

13、的重要污染源，进行RNA实验时应始终戴手套，并应勤换手套。提取的样品材料应尽可能新鲜，如果不能及时提取RNA，取样后应保存于液氮中。如何选择反转录引物？（1）两步法中反转录引物有oligo(dT)(12-18个核苷酸组成)、随机六聚寡核苷酸和基因特异引物，可根据不同的目的选择不同的引物。Oligo(dT)引物能与哺乳动物mRNA的3端poly(A)尾巴互补，作为一种通用引物用于cDNA第一链的合成。随机六聚寡核苷酸引物能与RNA模板的许多位点互补，因此，当RNA序列很长（3kb）或其中包含很多二级结构使oligo（dT）或基因特异引物很难与mRNA互补时，选择随机六聚寡核苷酸引物不失为一种良策

14、。RTPCR的产物产率很低？ 答：可能是因为反转录cDNA合成效率低，但更多情况下是因为cDNA扩增效率低。为了验证后者的可能性，可建立一系列PCR反应，这些PCR加入了不同数量的模板。假如染色后的凝胶上呈现不清晰的成片状的非特异性条带，这种实验结果往往是在PCR中加入过量的cDNA模板所致。因此，在许多PCR实验中用反转录反应产生的cDNA的10作为模板。在这种情况下，PCR扩增阶段需要另加模板。具体最适合的模板量，要靠预实验确定。一旦建立了模板的最佳浓度，其他的PCR参数可用系统的方式如改变Mg2浓度和复性条件来进一步优化。2、上述调整后问题依然存在，怎么办？答：1、通过含有甲醛的琼脂糖凝

15、胶电泳来检查RNA的完整性。2、建立含有对照mRNA、oligo(dT)引物和放射性元素标记示踪物的检测反应来检测cDNA的合成效率。3、将不同比例的RNA样品和对照样品混合，通过比较cDNA的产量来检测RNA样品中是否存在抑制剂。4、在继续进行PCR之前，纯化cDNA第一链的样品。3、RTPCR反应后，无PCR产物，怎么办？答：首先应严格按照说明书要求，进行control反应。如果对照正常，说明实验操作方面没有问题。应从RNA样品的纯度和添加量、引物的设计情况，参考文献的可信度以及RTPCR条件的设定等方面加以考虑；如对照反应不正常，应从实验操作的准确性、实验器具的处理、PCR仪的条件设定等

16、方面加以考虑。4、有些RT反应体系中，不加dNTP混合物，为什么？答：由于在这些RT反应体系中已经加了足够量的dNTP Mixture，因此在PCR反应中，不须再添加dNTP。如果在PCR反应时继续添加，虽然PCR反应仍可进行，但可能会降低DNA的扩增效率。RT-PCR的实验条件具有个性化网上的一个例子：我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。 记得我开始我的PCR时，按常规方法，提取总后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了次均