实验一 常用玻璃器皿的清洗及包扎

1、实验一常用玻璃器皿的清洗及包扎目的与要求（一）熟悉微生物实验所需各种常用器皿的名称和规格。（二）学会正确的清洗玻璃器皿的方法和包扎方法原理为了包装实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净，保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎，试管和三角瓶要做棉塞。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗净剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同，不同的器皿包扎方法也不同。材料与仪器（一）常用的各种玻璃器皿。（二）洗涤工具和去污粉、肥皂、洗涤液。操作步骤（一）清洗新玻璃器皿的清洗新购置的玻璃器皿均含有游离碱，故应先将其浸于洗液或2%的盐酸溶液中数小时，再用自来水冲洗干净。用过的玻璃器皿的清洗

2、（1）试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯可用瓶刷或海绵沾上肥皂、洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后在用自来水充分冲洗干净。经洗涤后，若内壁的水均匀分布在一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则需用洗涤液（或洗液）浸泡数小时，再用自来水充分冲洗，洗涤干净的器皿倒置与铁丝框内或有空心格子木架上，室内晾干。（2）玻璃吸管、滴管一般用完后应立即用清水和蒸馏水浸泡（或冲洗），免得干燥后难以冲洗干净，如附有污物可用洗液浸泡。（3）载玻片与盖玻片带有油污的应擦去有无后用热乙醇、丙酮、二甲苯等溶液浸泡1015min,溶液油垢然后用水冲洗，再用洗涤液浸泡、冲洗，干后置于95%乙醇中保存备用。（二）玻璃器皿的包扎培养皿常

3、用旧报纸或牛皮纸包紧，一般以510套培养皿作一包。包好后进行干热或湿热灭菌，如将培养皿放入金属（不锈钢）筒内进行热灭，则不必用纸包。试管和三角瓶试管管口和三角瓶都需要塞以棉花塞（或泡膜塑料塞），棉花塞的作用是起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管或三角瓶。棉花塞的制作要求使用棉花塞紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，不能过紧也不能过松，长度不少于管口直径的二倍，约2/3塞进管口。若干支试管用绳扎在一起，在棉塞部分外包裹牛皮纸或2层旧报纸，再扎好。三角瓶每个单独用牛皮纸或旧报纸包扎棉塞。3吸管洗净烘干后的吸管，在口吸的一端月0.5cm处，用尖头镊子或针塞入少许脱脂棉，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微

4、生物吸出管外，棉花要塞得松紧恰当。然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸的近左端，以45度左右的角度螺旋形卷起来，右端多余的报纸大一小结，不使散开。五、实验报告（一）结果检查实验效果（二）思考题能否用橡皮塞、木塞来代替棉塞，为什么？玻璃器皿清洗时应注意什么？实验二普通光学显微镜的构造和使用一、目的与要求（一）学习普通光学显微镜的结构、部分功能及使用方法。（二）学习并掌握油镜的原理的使用方法。二、原理普通光学显微镜由机械装置和光学系统2大部分构成。在光学系统中物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜中配置的几种物镜以油镜的放大倍数最大，与其他物镜相比，使用较特殊，需在载玻片

5、与镜头之间加滴镜油，以增加照明亮度和提高分辨率。三、材料与仪器（一）菌种金黄色葡萄球菌及枯草杆菌染色玻片标本，啤酒酵母水浸片。（二）其他香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。四、操作步骤（一）显微镜的安置置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘34cm,镜检时姿势要端正。（二）调节光源安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。（三）低倍镜观察将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10X物镜，使其接近标

6、本，用粗调节器（粗调螺旋）慢慢升起镜筒,出现图像后，再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细观察。（四）高倍镜观察在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物象清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录。（五）油镜观察在低倍镜或高倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高约2cm，然后在待观察区域滴加12滴香柏油，将油镜转到工作位置，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，将聚光器升至最高位置并

7、开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。（六）显微镜用后处理上升镜筒，取下载玻片。用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上的残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。将各部分还原，反光镜垂于镜座，将物镜转成“八字形“再向下旋，同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。五、实验报告（一）结果分别绘出在不同物镜下观察到的不同菌种的形态，同时注明放大倍数。（二）思考题油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意什么？显微镜中调节光线强弱的装置有哪些？实验三酵母菌形态观察

8、一、目的与要求观察酵母菌的形态及出芽繁殖方式。二、原理大小通常比细菌大几倍甚至于十几倍，大多数的酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的二分裂繁殖。用美兰支制成的水浸片，可观察酵母的形态和出芽繁殖方式以及进行死活细胞的鉴别（染成蓝色的为死细胞，无色的为活细胞）、三、材料与仪器（一）啤酒酵母，假丝酵母，汉逊酵母。（二）显微镜，载玻片，盖玻片，接种针，酒精灯。（三）吕氏美蓝染液。四、操作步骤（一）在干净载玻片中央加一滴吕氏美蓝染色液，以无菌操作接种环挑取少量酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。（二）取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下（以免产生气泡），使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干。

9、（三）将盖玻片置于载物台上，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。（四）染色约0.5h后再进行观察，注意四细胞数量是否增加。五、实验报告（一）结果绘图说明你所观察到的酵母形态特征。（二）思考题在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？酵母水浸片制作室应注意什么？实验十三培养基的制备一、目的与要求（一）学习制备培养基的基本技术。（二）制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。二、原理牛肉膏蛋白培养基时一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供繁殖之用。制作固体培养基时须加2%琼脂，培养细菌时，应用烯酸或稀碱将PH

10、调至中性或微碱性。牛肉膏蛋白培养基的配方：牛肉膏0.%5蛋白胨1%NaCL0.5%pH7.47.6.三、材料与仪器（一）试剂牛肉膏，蛋白胨，Nacl,琼脂1mol/L;NaoH1mol/LHCL（二）其他试管，三角烧杯，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布，棉花，牛皮纸，线绳，pH试纸，电炉，台秤。四、操作步骤（一）称量根据用量按比例依次称取各种成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水熔化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。（二）溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，逐一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需要不断搅拌。加热时应注意火力，勿使培养基烧焦

11、或溢出溶好后，不足所需水分。（三）调PH用1mol/LNaoH把pH调至所需范围。（四）过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。（五）分装按实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角瓶内，分装装置如实验图-8所示：分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引起污染。1液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。2固体分装分装试管，其装量不超过量筒的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。分装三角瓶，以不超过容积的1/2为宜。半固体分装装置以试管高度的1/3为宜，灭

12、菌后垂直待凝（六）加棉塞分装完毕后，在试管或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等），以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。（七）包扎棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。（八）保存灭菌后的培养基放入37C培养箱中培养24h,以检验灭菌的效果，无污染方可使用。五、实验报告（一）结果说明你配置培养基过程中的情况。（思考题）培养基配置时应注意什么问题？为什么？分装培养基时为什么要使用弹簧夹？培养基配好后，为什么要立即灭菌？实验四干热灭菌及高压蒸汽灭菌一、目的与要求二、原理干热灭菌时利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变形而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本省的含水

13、量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固越块，反之含水量越小，则凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度高（160170C）,时间长（12h）.高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放入一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾产生蒸汽，水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续温度，导致菌体蛋白质凝固变形而达到灭菌的目的。一般培养及用0.1MPa（相当于15Ib/In2或1.05kg/cm2）121.5CO1530min可达到彻底灭菌，灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。三、材料与仪器吸管，培养皿，试管，电热干燥箱，

14、手提式高压灭菌蒸汽灭菌锅，牛肉膏蛋白胨培养基、蒸馏水。四、操作步骤（一）干热灭菌法，适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌。培养基不适用。将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留一定间隙），管好箱门。接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加热升温状态，至箱内达到100C时关闭排气孔。当温度升到160170C时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2ho切断电源，冷却至70C时，打开箱门，取出灭菌物品（未将至70C以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）、（二）高压蒸汽灭菌首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。放回

15、内层锅，并装入待灭菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装的太挤，以免妨碍蒸汽流通过影响灭菌效果，三角瓶口部要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。加盖，旋紧。打开排气阀，使水沸腾以排除锅的冷空气，待冷空气排尽后，关上排气阀让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内达到所需压力时，控制热源,维持压力至所需时间。一般灭菌采用121摄氏度保存20-30分钟。停止加热，待压力表的压力至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。注意，当压力不为零时，不能开盖取物，否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。高压灭菌锅上的安

16、全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。五、实验报告（一）结果检查灭菌是否彻底。（二）思考题干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？为什么干热灭菌所需温度要比湿热灭菌高?高压蒸汽灭菌时，为什么要排尽锅内的冷空气？实验十七微生物的平板菌落基数法一，目的与要求掌握用平板菌落计数法来测定一定数量样品中微生物细胞数目。二，原理平板菌落计数法是通过将样品制成一系列不同的稀释液，使样品中微生物个体分散成当个细胞状态。再取一定量的稀释液接种，使其均匀分部于培养皿中培养基上。培养后统计菌落数目，一般认为每一个菌落是由一个细胞增殖后形成，所以可计算出样品的含菌量。三，材料与仪器（一）样品，无菌水。（二）

17、培养基普通营养琼脂培养基。（三）培养皿，恒温培养箱等。四，实验步骤（一）样品处理在无菌的条件下，精确称取10g固体样品或量取10mL液体样品。2将10g固体样品迅速倒入已灭菌的装有玻璃珠和90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡1530min，制成稀释10倍的菌悬液，10ml液体样品依稀释10倍。用1支试管吸取1mL稀释10倍的菌液，加入第一支有9ml无菌水的试管中，摇匀后得稀释100倍的菌液。换用一支试管依次稀释到103、1010、10倍，稀释程度以样品中可能含有的活菌数多少而定。（制平板）1混合平板培养计数法上述样品稀释好后，用吸管取适当稀释倍数的样品稀释液1mL,放入已灭菌的培养皿中，再迅速倒

18、入约15mL融化而冷却至50C左右的琼脂培养基，将培养皿按顺、反时针方向旋转摇动，使样品稀释液和培养基混匀，放平，冷却凝固后倒转放置，在被测微生物最适温度下培养（每一个稀释样品各做三个培养皿），当出现菌落后，用计数器进行计数。2涂抹平板培养计数法先将融化并冷却至50C左右的15ML琼脂培养基注入已灭菌的培养皿中。放平冷却凝固后，将不同稀释度的样品液0.2mL于培养皿中央，并用玻璃棒均匀地涂抹在平板表面，同意浓度可用一个玻璃棒连续涂抹。否则，需灭菌后再用。涂抹后的培养皿，暂放几小时，待稀释液中的水分干后将培养皿倒置保温培养，菌落长出后，用计数器进行计数。五、实验报告（一）结果2计算混合平板培养计

19、算公式：每克样品菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数X稀释倍数涂抹平板培养计算公式：每克样品菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数X稀释倍数X5（思考题）平板技术法的优缺点是什么？AYUI;09RAqweLO6EZSGD3A5RTG试验五酵母菌形态观察、目的与要求观察酵母菌的形态及出芽繁殖方式。、原理大小通常比细菌大几倍甚至于十几倍，大多数的酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的二分裂繁殖。用美兰支制成的水浸片，可观察酵母的形态和出芽繁殖方式以及进行死活细胞的鉴别（染成蓝色的为死细胞，无色的为活细胞）、三、材料与仪器（一）啤酒酵母，假丝酵母，汉逊酵母。（二）显微镜，载玻片，盖玻片，接种针，酒精灯。（三

20、）吕氏美蓝染液。四、操作步骤（一）在干净载玻片中央加一滴吕氏美蓝染色液，以无菌操作接种环挑取少量酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。（二）取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下（以免产生气泡），使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干。（三）将盖玻片置于载物台上，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。（四）染色约0.5h后再进行观察，注意四细胞数量是否增加。五、实验报告（一）结果绘图说明你所观察到的酵母形态特征。（二）思考题在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？酵母水浸片制作室应注意什么？实验十三培养基的制备一、目的与要求（一）学习制备

21、培养基的基本技术。（二）制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。二、原理牛肉膏蛋白培养基时一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供繁殖之用。制作固体培养基时须加2%琼月旨，培养细菌时，应用烯酸或稀碱将PH调至中性或微碱性。牛肉膏蛋白培养基的配方：牛肉膏0.%5蛋白胨1%NaCL0.5%pH7.47.6.三、材料与仪器（一）试剂牛肉膏，蛋白胨，Nacl,琼脂1mol/L;NaoH1mol/LHCL（二）其他试管，三角烧杯，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布，棉花，牛皮纸，线绳，pH试纸，电炉，台秤。四、操作步骤（一）称量根据用量按比例依次称取各种成

22、分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水熔化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。（二）溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，逐一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需要不断搅拌。加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，不足所需水分。（三）调PH用1mol/LNaoH把pH调至所需范围。（四）过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。（五）分装按实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角瓶内，分装装置如实验图-8所示：分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引起污染。1液体分装分装高度以试管高度的

23、1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。2固体分装分装试管，其装量不超过量筒的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。分装三角瓶，以不超过容积的1/2为宜。半固体分装装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝（六）加棉塞分装完毕后，在试管或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等），以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。（七）包扎棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。（八）保存灭菌后的培养基放入37C培养箱中培养24h,以检验灭菌的效果，无污染方可使用。五、实验报告（一）结果说明你配置培养基过程中的情况。（思考题

24、）培养基配置时应注意什么问题？为什么？分装培养基时为什么要使用弹簧夹？培养基配好后，为什么要立即灭菌？实验十三干热灭菌及高压蒸汽灭菌一、目的与要求二、原理干热灭菌时利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变形而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本省的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固越块，反之含水量越小，则凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160170C）,时间长（12h）.高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放入一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾产生蒸汽，水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续温度，导致菌体蛋白质凝

25、固变形而达到灭菌的目的。一般培养及用0.1MPa（相当于15Ib/In2或1.05kg/cm2）121.5CO1530min可达到彻底灭菌，灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。三、材料与仪器吸管，培养皿，试管，电热干燥箱，手提式高压灭菌蒸汽灭菌锅，牛肉膏蛋白胨培养基、蒸馏水。四、操作步骤（一）干热灭菌法，适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌。培养基不适用。将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留一定间隙），管好箱门。接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加热升温状态，至箱内达到100C时关闭排气孔。当温度升到160170

26、C时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2ho切断电源，冷却至70C时，打开箱门，取出灭菌物品（未将至70C以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）、（二）高压蒸汽灭菌首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。放回内层锅，并装入待灭菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装的太挤，以免妨碍蒸汽流通过影响灭菌效果，三角瓶口部要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。用电炉或其他方法加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅的冷空气，待冷空气排尽

27、后，关上排气阀让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升当锅内达到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。停止加热，待压力表的压力至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。注意，当压力不为零时，不能开盖取物，否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。五、实验报告（一）结果检查灭菌是否彻底。（二）思考题干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？为什么干热灭菌所需温度要比湿热灭菌高?高压蒸汽灭菌时，为什么要排尽锅内的冷空气？实验十七微生物的平板菌落基数法一，目的与要求

28、掌握用平板菌落计数法来测定一定数量样品中微生物细胞数目。二，原理平板菌落计数法是通过将样品制成一系列不同的稀释液，使样品中微生物个体分散成当个细胞状态。再取一定量的稀释液接种，使其均匀分部于培养皿中培养基上。培养后统计菌落数目，一般认为每一个菌落是由一个细胞增殖后形成，所以可计算出样品的含菌量。三，材料与仪器（一）样品，无菌水。（二）培养基普通营养琼脂培养基。（三）培养皿，恒温培养箱等。四，实验步骤（一）样品处理在无菌的条件下，精确称取10g固体样品或量取10mL液体样品。2将10g固体样品迅速倒入已灭菌的装有玻璃珠和90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡1530min，制成稀释10倍的菌悬液，1

29、0ml液体样品依稀释10倍。用1支试管吸取1mL稀释10倍的菌液，加入第一支有9ml无菌水的试管中，摇匀后得稀释100倍的菌液。换用一支试管依次稀释到103、1010、10倍，稀释程度以样品中可能含有的活菌数多少而定。（制平板）混合平板培养计数法上述样品稀释好后，用吸管取适当稀释倍数的样品稀释液1mL,放入已灭菌的培养皿中，再迅速倒入约15mL融化而冷却至50C左右的琼脂培养基，将培养皿按顺、反时针方向旋转摇动，使样品稀释液和培养基混匀，放平，冷却凝固后倒转放置，在被测微生物最适温度下培养（每一个稀释样品各做三个培养皿），当出现菌落后，用计数器进行计数。2涂抹平板培养计数法先将融化并冷却至50

30、C左右的15ML琼脂培养基注入已灭菌的培养皿中。放平冷却凝固后，将不同稀释度的样品液0.2mL于培养皿中央，并用玻璃棒均匀地涂抹在平板表面，同意浓度可用一个玻璃棒连续涂抹。否则，需灭菌后再用。涂抹后的培养皿，暂放几小时，待稀释液中的水分干后将培养皿倒置保温培养，菌落长出后，用计数器进行计数。五、实验报告（一）结果计算混合平板培养计算公式：每克样品菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数X稀释倍数涂抹平板培养计算公式：每克样品菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数X稀释倍数X5（思考题）平板技术法的优缺点是什么？实验二普通光学显微镜的构造和使用一、目的与要求（一）学习普通光学显微镜的结构、部分功能及使

31、用方法。（二）学习并掌握油镜的原理的使用方法。二、原理普通光学显微镜由机械装置和光学系统2大部分构成。在光学系统中物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜中配置的几种物镜以油镜的放大倍数最大，与其他物镜相比，使用较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，以增加照明亮度和提高分辨率。三、材料与仪器（一）菌种金黄色葡萄球菌及枯草杆菌染色玻片标本，啤酒酵母水浸片。（二）其他香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。四、操作步骤（一）显微镜的安置置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘34cm,镜检时姿势要端正。（二）调节光源安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用

32、反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。（三）低倍镜观察将标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10X物镜，使其接近标本，用粗调节器（粗调螺旋）慢慢升起镜筒,出现图像后，再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细观察。（四）高倍镜观察在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物象清晰，利用推进器移动

33、标本仔细观察并记录。（五）油镜观察在低倍镜或高倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高约2cm，然后在待观察区域滴加12滴香柏油，将油镜转到工作位置，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。（六）显微镜用后处理上升镜筒，取下载玻片。用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上的残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。将各部分还原，反光镜垂于镜座，将物镜转成“八字形“再向

34、下旋，同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。五、实验报告（一）结果分别绘出在不同物镜下观察到的不同菌种的形态，同时注明放大倍数。（二）思考题油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意什么？显微镜中调节光线强弱的装置有哪些？试验五酵母菌形态观察一、目的与要求观察酵母菌的形态及出芽繁殖方式。二、原理大小通常比细菌大几倍甚至于十几倍，大多数的酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的二分裂繁殖。用美兰支制成的水浸片，可观察酵母的形态和出芽繁殖方式以及进行死活细胞的鉴别（染成蓝色的为死细胞，无色的为活细胞）、三、材料与仪器（一）啤酒酵母，假丝酵母，汉逊酵母。（二）显微镜，载玻片，盖玻片，接种针，酒

35、精灯。（三）吕氏美蓝染液。四、操作步骤（一）在干净载玻片中央加一滴吕氏美蓝染色液，以无菌操作接种环挑取少量酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。（二）取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下（以免产生气泡），使其盖在菌液上，将多余菌液用吸水纸吸干。（三）将盖玻片置于载物台上，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。（四）染色约0.5h后再进行观察，注意四细胞数量是否增加。五、实验报告（一）结果绘图说明你所观察到的酵母形态特征。（二）思考题在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？酵母水浸片制作室应注意什么？实验十三培养基的制备一、目的与要求（一

36、）学习制备培养基的基本技术。（二）制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。二、原理牛肉膏蛋白培养基时一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供繁殖之用。制作固体培养基时须加2%琼脂，培养细菌时，应用烯酸或稀碱将PH调至中性或微碱性。牛肉膏蛋白培养基的配方：牛肉膏0.%5蛋白胨1%NaCL0.5%pH7.47.6.三、材料与仪器（一）试剂牛肉膏，蛋白胨，Nacl,琼脂1mol/L;NaoH1mol/LHCL（二）其他试管，三角烧杯，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布，棉花，牛皮纸，线绳，pH试纸，电炉，台秤。四、操作步骤（一）称量根据用量按比例依次称

37、取各种成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水熔化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。（二）溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，逐一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需要不断搅拌。加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，不足所需水分。（三）调PH用1mol/LNaoH把pH调至所需范围。（四）过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。（五）分装按实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角瓶内，分装装置如实验图-8所示：分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引起污染。1液体分装分装高度以试

38、管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。2固体分装分装试管，其装量不超过量筒的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。分装三角瓶，以不超过容积的1/2为宜。半固体分装装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝（六）加棉塞分装完毕后，在试管或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等），以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。（七）包扎棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。（八）保存灭菌后的培养基放入37C培养箱中培养24h,以检验灭菌的效果，无污染方可使用。五、实验报告（一）结果说明你配置培养基过程中的情况。

39、（思考题）培养基配置时应注意什么问题？为什么？分装培养基时为什么要使用弹簧夹？培养基配好后，为什么要立即灭菌？实验十三干热灭菌及高压蒸汽灭菌一、目的与要求二、原理干热灭菌时利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变形而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本省的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固越块，反之含水量越小，则凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度高（160170C），时间长（12h）.高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放入一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热,使灭菌锅内水沸腾产生蒸汽，水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续温度，导致菌体

40、蛋白质凝固变形而达到灭菌的目的。一般培养及用0.1MPa（相当于15Ib/In2或1.05kg/cm2）121.5CO1530min可达到彻底灭菌，灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。三、材料与仪器吸管，培养皿，试管，电热干燥箱，手提式高压灭菌蒸汽灭菌锅，牛肉膏蛋白胨培养基、蒸馏水。四、操作步骤（一）干热灭菌法，适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌。培养基不适用。将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留一定间隙），管好箱门。接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加热升温状态，至箱内达到100C时关闭排气孔。当温度升到160170C时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。切断电源，冷却至70C时，打开箱门，取出灭菌物品（未将至70C以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）、（二）高压蒸汽灭菌首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。放回内层锅，并装入待灭菌物