乙肝丙肝核酸检测的新平台临床课件

1、乙肝丙肝核酸检测的新平台临床乙肝丙肝核酸检测的新平台临床目前乙肝和丙肝临床治疗过程中遇到的主要问题治疗终点无法准确判定有些病人经一段时间治疗后DNA/RNA检测结果忽阴忽阳，但临床症状依然明显不能及时预测耐药（病毒学突破）核苷（酸）类似物治疗后病毒DNA/RNA快速下降至检测限以下，不久却发现病毒出现反跳疗效的准确监测？治疗后12或24周病毒DNA/RNA下降幅度直接决定预后问题的根源在哪里？目前乙肝和丙肝临床治疗过程中遇到的主要问题治疗终点无法准确判内 容HBV核酸检测的现状与需要HCV核酸检测的现状与需要罗氏的CAP/CTM能带来什么益处总结内 容HBV核酸检测的现状与需要HBV DNA监

2、测在抗病毒治疗中的临床应用HBV DNA是监测抗病毒治疗响应和时间的关键标志物HBV 治疗的路线图理念，为HBV DNA监测用于临床实践提供了指导对用药耐药性的监测（拉米夫定YMDD，）肝移植HBV复发风险的降低（术前，术后）HBV DNA监测在抗病毒治疗中的临床应用HBV DNA是监HBV DNA监测的临床应用HBV治疗路线图 Keeffe E. Clin Gastro Hepatology 2007;5:890-897. 侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治疗方案优化，中国肝脏病杂志HBV DNA监测的临床应用Keeffe E. Clin G国产试剂现状目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的

3、问题：HBV试剂盒说明：5005107 IU/mL较可信的测试范围：1045107 IU/mL对部分发生HBV病毒突变的病人无法准确检测注：1 IU/mL= 1 copy/mL国产试剂现状目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的问题：内 容HBV核酸检测的现状与需要HCV核酸检测的现状与需要罗氏的CAP/CTM能带来什么益处总结内 容HBV核酸检测的现状与需要HCV DNA监测在抗病毒治疗中的临床应用HCV病毒感染是可治愈的疾病HCV RNA检测可以有效指导临床用药治疗的终点是核酸检测为阴性（核酸检测可以直接指导停药时机）HCV DNA监测在抗病毒治疗中的临床应用HCV病毒感染是可Scher

4、ing-Plough Corp.CAP/CTM HCV样本管/反应管管盖抓手Peginterferon alfa-2aHEPSERA (Adefovir dipivoxil) package insert Gilead Sciences.COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 96系统（带连接系统）HCV RNA检测可以有效指导临床用药侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治疗方案优化，中国肝脏病杂志, Journal of Medical Virology 2005, 77:486490治疗结束后24周，未检测到HCV RNA可针对疑难病例、低病毒载量、长期用药或高端病人治疗期间

5、曾有HCV RNA低于检出限，但尚未停药即出现HCV RNA重新升高真正实现 “样品进，结果出”Christoph Sarrazina et al.检测通量可达4*24测试北京友谊医院（贾继东）TYZEKA (Telbivudine) Package Insert.0 in serum and plasma matrices.慢性HCV治疗方案治疗应答名称描述快速病毒学应答（RVR）4周时未检测到HCV RNA早期病毒学应答（EVR）- 完全早期病毒学应答（cEVR）未RVR，但12周时未检测到HCV RNA- 部分早期病毒学应答（pEVR）未RVR，12周时HCV RNA拷贝数下降2log1

6、0，但仍检测到HCV RNA没有应答12周时HCV RNA拷贝数下降2log10治疗结束（EOT）治疗结束未检测到HCV RNA持续病毒学应答（SVR）治疗结束后24周，未检测到HCV RNA反弹治疗期间曾有HCV RNA低于检出限，但尚未停药即出现HCV RNA重新升高复发治疗期间HCV RNA低于检出限，但治疗结束（停药）后HCV RNA重新升高Schering-Plough Corp.慢性HCV治疗方案慢性HCV治疗方案用药12周早期病毒学反应HCV RNA下降2log继续治疗至48周继续治疗至24周考虑停药慢性HCV治疗方案用药12周早期病毒学反应HCV RNA下国产试剂现状目前使用的

7、国产试剂能解决的问题，不能解决的问题：HCV试剂盒说明：5005107 IU/mL较可信的测试范围：1045107 IU/mL注：1 IU/mL= 1 copy/mL国产试剂现状目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的问题：内 容HBV核酸检测的现状与需要HCV核酸检测的现状与需要罗氏的CAP/CTM能带来什么益处总结内 容HBV核酸检测的现状与需要全世界第一台用于体外诊断的全自动荧光定量分子诊断系统真正实现 “样品进，结果出” 全球安装超过 2,000台，国内安装超过 40台COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 系统COBAS AmpliPrep / COBAS Taq

8、Man48系统COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 96系统（带连接系统）COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 96系统（无连接系统）全世界第一台用于体外诊断的全自动荧光定量分子诊断系统COBACOBAS AmpliPrep仪器简介全自动系统，自动进行核酸提取纯化和PCR反应体系配制 基于MGP磁珠分离技术，确保高质量的核酸提取纯化最多72个样品可以同时上机，运行中可连续装载上架，提高工作效率包括耗材、样品、试剂均可以连续上样COBAS AmpliPrep仪器简介全自动系统，自动进行核DNA或者RNA1.裂解、稳定和去蛋白2.核酸捕获病毒或细胞3

9、.冲洗4.洗脱37C孵育COBAS AmpliPrep仪器MGP 磁珠分离技术室温80C孵育DNA1.裂解、稳定和去蛋白2.核酸捕获病毒或细胞3.冲洗4取SPU枪头样本管/反应管管盖抓手样本初始体积感应器取试剂钢针CAP机械臂介绍样本管/反应管结构CAP机械臂介绍样本管/反应管结构COBAS TaqMan/COBAS TaqMan 48分析仪简介检测通量可达4*24测试独立的24孔热循环仪TaqMan 48有2个模块，TaqMan 96有4个模块最多可同时进行4个不同的分析检测 操作简单，核酸扩增和检测全部自动完成实时定量PCR检测技术，卓越的检测性能，灵敏度高和特异性好，动态范围宽COBAS

10、 TaqMan/COBAS TaqMan 48分析HBV-DNA定量测试用于药品FDA注册试验通用名商品名 FDA批准日期关键的HBV-DNA测试Interferon alfa-2b-2b 干扰素 INTRON A1991N/ALamivudine拉米夫定EPIVIR-HBV1998杂交研究解决方案 1Adefovir dipivoxil阿德福韦酯 HEPSERA2002Amplicor Monitor 2Entecavir恩替卡韦BARACLUDE2005Cobas Amplicor 3Peginterferon alfa-2a聚乙二醇干扰素-2aPEGASYS2005Cobas Ampli

11、cor 4Telbivudine替比夫定TYZEKA2006Cobas Amplicor 5Tenofovir替诺福韦VIREAD (HIV)Phase 3Cobas TaqMan 6 INTRON A (Interferon alfa-2b) package insert. Schering-Plough Corp. Kenilworth, NJ 2. EPIVIR-HBV (Lamivudine) package insert GlaxoSmithKline, Research Triangle park, NC 3. HEPSERA (Adefovir dipivoxil) packag

12、e insert Gilead Sciences. Foster City, CA 4. Pegasys (Peginterferon alfa-2a) package insert. Hoffmann-La Roche Inc. Nutley, NJ 5. TYZEKA (Telbivudine) Package Insert. Novartis Pharmaceuticals Corp. E Hanover, NJ 6. Marcellin P et al. Hep DART 2007 Meeting Abstract 63, Dec 9-13 2007, Lahaina, HIHBV-D

13、NA定量测试用于药品FDA注册试验通用名商品名 F国外发表的文献Evaluation of initial virological response to adefovir and development of adefovir-resistant mutations in patients with chronic hepatitis B. Gallego et al., Journal of Viral Hepatitis, , 15, 392398Evaluation of an automated, highly sensitive, real-time PCR-based assay

14、 (COBAS AmpliprepTM/COBAS TaqManTM) for quantification of HCV RNA. Christoph Sarrazina et al., Journal of Clinical Virology , , 43, 162168COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan Hepatitis B Virus(HBV) Test: a Novel Automated Real-Time PCR Assay for Quantification of HBV DNA in Plasma. Tiziano Allice et al., Jo

15、urnal of Clinical Microbiology, Mar. 2007, p. 828834Evaluation of the COBAS AmpliPrep-total nucleic acid solation-COBAS TaqMan hepatitis B virus (HBV) quantitative test and comparison to the VERSANT HBV DNA 3.0 assay. Ronsin C et al., Journal of Clinical Microbiology 2006 vol.44(no.4) Comparison of

16、the COBAS TaqManTM HBV Test With the COBAS Amplicor MonitorTM Test for Measurement of Hepatitis B Virus DNA in Serum. Simon Siu-Man Sum et al., Journal of Medical Virology 2005, 77:486490Hepatitis B virus (HBV) genotype determination by the COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 in serum and pl

17、asma matrices. Goedel S et al., Journal of Clinical Virology Jul;45(3):232-6Comparison of Versant HBV DNA 3.0 and COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan assays for hepatitis B DNA quantitation : Possible clinical implications. GARBUGLIA A. R. et al., Journal of virological methods 2007, vol. 146, no1-2, pp. 2

18、74-280 Performance of the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan Real-Time PCR Assay for Hepatitis B Virus DNA Quantification. Stephane Chevaliez et al., Journal of Clinical, May , p. 17161723国外发表的文献Evaluation of initial vHBV的定量检测性能指标国产HBV试剂CAP/CTM HBV灵敏度 (LOD)500 IU/mL？12 IU/mL检测范围1045107 IU/mL54 - 1.1108 IU

19、/mL定量方法外标法定量内标法定量其它对部分发生HBV病毒突变的病人无法准确检测涵盖亚型: A-G加强pre-core突变检测注：国产试剂1 IU/mL= 1 copy/mLHBV的定量检测性能指标国产HBV试剂CAP/CTM HBVHCV的定量检测性能指标国产HCV试剂CAP/CTM HCV灵敏度 (LOD)500 IU/mL？15 IU/mL检测范围1045107 IU/mL43 6.9107 IU/mL定量方法外标法定量内标法定量其它未知1-6 型 (能区分 0.5 log浓度变化)HCV的定量检测性能指标国产HCV试剂CAP/CTM HCV定量原理外标法定量（国产试剂）使用一组（4管）

20、外部标准品定量，分别为5104到5107 IU/mL未考虑各患者血液成分间的差异性对结果的影响定量原理外标法定量（国产试剂）使用一组（4管）外部标准品定定量原理内标定量Internal Quantitation Standard(CAP/CTM)内标是已知拷贝数的人工构建核酸，加入每一反应管，与靶核酸竞争扩增，管内定量可提示反应是否存在反应抑制，避免假阴性结果充分考虑管间反应效率的差异，得到可靠精确的结果 定量原理内标定量Internal QuantitationNutley, NJ 5.全自动系统，自动进行核酸提取纯化和PCR反应体系配制INTRON A (Interferon alfa-2

21、b) package insert.治疗结束后24周，未检测到HCV RNAHEPSERA (Adefovir dipivoxil) package insert Gilead Sciences.Pegasys (Peginterferon alfa-2a) package insert.12周时HCV RNA拷贝数下降2log10, Journal of Clinical, May , p.肝移植HBV复发风险的降低（术前，术后）HCV核酸检测的现状与需要全世界第一台用于体外诊断的全自动荧光定量分子诊断系统北京大学人民医院肝炎所（魏来）EPIVIR-HBV检测通量可达4*24测试HEPSER

22、A (Adefovir dipivoxil) package insert Gilead Sciences.COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系统封闭样品管输入，封闭PCR管输出 标准化，重复性纯化好的核酸主反应液PCR反应体系的配制试剂、样品和耗材的装载上机样品处理单元K-枪头K-管样品试剂Nutley, NJ 5.COBAS AmpliPrep/Branchburg生产厂房罗氏 超过亿美金，建成全球最大分子诊断试剂生产基地目前每月生产14万套试剂Branchburg生产厂房罗氏 超过亿美金，建成全球最罗氏分子诊断严格的生产和质控体系为整个行业设定了高标准1. 原料严格把关3. GMP生产2. 原料质检4. GMP生产6. 成品质检5. 试剂盒成品7. 资料入档罗氏分子诊