免疫分析以及免疫传感器

1、关于免疫分析及免疫传感器第1页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.1 引言临床、生物电化学及环境分析物的检测需要快速、简便的分析方法基于抗体-抗原相互作用的免疫分析及免疫传感器由于其特异性及灵敏性显示良好的前景抗体与被分析物（通常指抗原）在免疫分析体系或免疫传感器界面形成稳定的复合物，通过分子识别达到高度的特异性灵敏度取决于以下几个方面：采用与分析物高亲和性特异结合的抗体；抗体在免疫分析或免疫传感器界面的固定排列方式；合适的信号检测系统第2页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四放射免疫分析：放射活性物半衰期短、损害健康、污物难处理等 光学免疫分析

2、：对于有色样品及不纯样品检测的灵敏性有一定限制 电化学免疫分析及免疫传感器：快速、简便、经济等特点，微型化，均相检测第3页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四本章主要介绍一些基础背景知识，包括抗体结构和抗体-抗原相互作用，这对所有采用特殊的免疫分析模式的免疫分析和免疫传感器来说，都是至关重要的因素。重点介绍电化学免疫分析和免疫传感器的发展现状，以便能够比较容易地理解该领域取得的成就，并加以应用。第4页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四 4.2 抗体-抗原相互作用免疫分析和免疫传感器都是通过抗体对抗原的特异性分子识别来进行分析的系统。抗体是一类称为免

3、疫球蛋白（Ig）的糖蛋白，通常分为5类（IgA、IgG、IgM、IgD、IgE），其中IgG是最主要的成分（约占70%），经常用于免疫分析技术中。第5页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四抗体分类 根据重链C区氨基酸组成及排列顺序不同 抗体可分为五类第6页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四L链L链H链H链N端C端四肽链结构 链间二硫键连接，呈“Y”形两条相同的重链和两条相同的轻链上部为N端，下部为C端第7页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区(Variable Region ）和恒定区（C

4、onstant Region）可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变化较大恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序及含糖量都比较稳定可变区与恒定区第8页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四铰链区根据氨基酸序列的可变性，可分为恒定区（C区）和可变区（V区）第9页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四图4.1抗体Y型结构示意图。介于重链和轻链之间的区域即为抗原结合区域，“Y”型的开臂部分记为F(ab)2,而底部无抗原结合活性的区域记为Fc。第10页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四其中，K为反应平衡时的速率常数；Ab-Ag为抗体-

5、抗原复合物。K的范围为1061012 L mol -1，通常只有亲和常数K较大的抗体（108 L mol-1）显示较低的交叉反应性。抗体（Ab）-抗原（Ag）的结合遵循以下平衡方程：这些性质使得许多抗体成为免疫分析及生物传感器设计中理想的生物识别成分。第11页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四 单克隆抗体特别适用于免疫分析。单克隆抗体是由单一细胞系合成的，因此具有相同的抗原决定簇特异性和亲和性，是可以大量制备的均质抗体。与多克隆抗体相比，单克隆抗体显示更高的特异性和均质性，可减少纯化步骤。第12页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四第13页，共16

6、6页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.3 免疫分析及免疫传感器免疫分析是一种利用抗体作为待测抗原（通常为被分析物）的主要结合试剂来进行定量分析的方法。免疫分析的最终结果通常是研究抗体-抗原之间的结合，以及游离抗原与抗原-抗体复合物之间的识别。所有的免疫分析都是基于测定识别位点的结合率，即测定结合位点数或间接测定未结合位点数。第14页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四免疫分析基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段；免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性

7、质与含量。第15页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四免疫的原理 Ag + Ab AgAb 特异性、灵敏性 在Ag，Ab反应中，用容易示踪的化学物质标记一种反应物，以了解反应是否发生，发生部位，以及发生的程度（即对未知成分的样品进行定性、定位及定量分析）。第16页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四免疫学检测历史演进放射免疫检测（兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院）；酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用）；以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术（20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。第17页

8、，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.3.1 酶联免疫法免疫酶技术：把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来。它具有免疫荧光试验和放射免疫试验的优点，并克服上述两种方法的缺点。酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长，免疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定量测定，所得结果比较客观。第18页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四酶免疫测定或免疫酶技术是指酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应。它主要包括两个方面：免疫过氧化物酶法：以过氧化物酶作为标记，与抗原或抗体结合，然后根据酶与其底物间所产生的不溶性颜色

9、产物，借助于光学或电子显微镜观察细胞及亚细胞水平的抗原或抗体。酶联免疫吸附法（ELISA)：根据可溶性抗原或抗体与不溶性固相载体结合后，还保留其免疫活性，结合了作为标记的酶催化作用。第19页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四 ELISA的基本原理和方法 ELISA的种类和变化 ELISA的特点 ELISA的应用实例ELISA第20页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.3.1.1 基本原理它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相

10、的抗原或抗体（免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（标记物）酶作用的底物（显色剂）第21页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。第22页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，因此可借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗原。 这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可

11、以用分光光度计（酶标仪）加以测定。 其方法简单，方便迅速，特异性强。第23页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.3.1.2 酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应。第24页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四酶 底 物显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺四甲基联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 橘红色黄色棕色兰色蓝绿色

12、492460449425642碱性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 黄色红色 400500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 黄色深蓝色 405420 -半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG) 荧光黄色 360,450420 第25页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.3.1.3 ELISA的种类和变化 （一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法 （四）捕获法测IgM抗体重点第26页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四（一）双抗体夹心法方法：用已知抗体包

13、被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等第27页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四步骤：A 将已知抗体吸附于载体上，温育后清洗；B 加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与吸附的抗体结合，温育后清洗；C 加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；D 加入酶作用底物，产生显色反应，颜色的改变与所加的待检标本溶液中的抗原量成正比。第28页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四第29页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四1、已知抗体包 被于载体表面3、加酶标抗体 与抗原

14、结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物 不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包 被于载体表面2、加待检物无抗 原与抗体结合3、加酶标抗体 无抗原结合+-EEEEEEEEE第30页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四（二）间接法方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定第31页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四步骤：A 将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙

15、烯板或聚乙苯乙烯小珠），经温育后清洗；B 加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则与吸附的抗原结合，温育后清洗；C 加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗抗体与吸附的抗原抗体复合物结合，温育后清洗；D 加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。第32页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四第33页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四1、已知抗原吸附于载体表面2、加待检物无抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig与抗体结合4、加酶作用的底物产生颜色1、已知抗体吸附于载体表面2、加待检物有抗体与抗原结合3、加

16、酶标的抗Ig抗体4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-EEEEEEEEE+第34页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四（三）竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）第35页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四步骤：A 将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗；B 将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原溶液以适当比例混合，加入已包被的载体孔中，温育后清洗；C 加入酶作用的底物，产生显色反应。色深表示结合的酶标

17、记抗原多，而待检溶液中未标记的抗原量少；反之，色浅表示结合的酶标记抗原少，而待检溶液中抗原量多。第36页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四第37页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四洗涤洗涤竞争法测抗原+-EEEEEEE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合E第38页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四 对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程

18、度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。 第39页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四 应用： 病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体（四）捕获法第40页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四捕获法 原理：抗人IgM链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体 底物显色 第41页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四洗涤

19、洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EEEEE 1、固相化抗人IgM1、固相化抗人IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色第42页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.3.2竞争性免疫分析体系 图4.2 竞争性免疫分析示意图 将样品与已标记待测物混合后再去竞争有限的抗体结合位点标记复合物产生的信号与样品中待测物的量成反比关系 第43页，共166页，2022年，

20、5月20日，13点51分，星期四基于竞争免疫分析的免疫传感器用来检测小分子物质雌二醇 图4.3 竞争免疫分析检测雌二醇的结构示意图 第44页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四E. Zacco, R. Galve, M.P. Marco, S. Alegret, M.I. Pividori, Biosens.Bioelectron. 22 (2007) 1707.Fig. 6. Schematic representation of the electrochemical competitive immunosensing strategy for the detecti

21、on of atrazine in orange juice with ProtA-GEB-based biosensors, showing the immobilization (A and B) and the competitive immunological reaction (C).第45页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四竞争性电化学免疫分析和免疫传感器还广泛应用于重要的临床分析物的检测。尽管竞争免疫分析比较简单，但其缺点在于待测物标记后与抗体的结合能力可能减低甚至消失，特别是当标记物靠近抗原决定簇时，此现象尤为突出。 第46页，共166页，2022年，5

22、月20日，13点51分，星期四非竞争性免疫分析体系（即双抗体夹心免疫分析）通过过量的抗体与抗原反应，使抗原与样品溶液分离，形成的免疫复合物再与过量的信号二抗反应，其中二抗只特异性地与固定的抗体-抗原复合物结合。 4.3.3 非竞争性免疫分析体系 非竞争性免疫分析（b）示意图 第47页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四通常需要加入封闭剂减少非特异性反应当检测体系中信号抗体的量过多时也应考虑非特异性吸附问题该法特异性强，但只适用于两个抗原决定簇能够同时被识别的待测物的定量分析 第48页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四利用非竞争性免疫分析体系检测食品

23、中的致病菌 图4.4 流动免疫传感器的示意图。（1）液体进口，（2）碳集电器，（3）可弃免疫柱，（4）高度分散的抗体修饰的碳颗粒（免疫吸附剂），（5）碳对电极，（6）Ag/AgCl参比电极，（7）液体出口。 对斯特杆菌的检测限为10 cell mL-1，线性范围101500 cell mL-1。 第49页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.4 抗体固定模式 捕获抗体在固相表面的固定方式是一个关键的问题比较理想的固定方法是所固定的捕获抗体以空间位阻最小的方式排列，易于与目标抗原反应抗体固定后与抗原的结合能力没有明显改变这些性质与免疫体系所能达到的灵敏度和动力学范围有直接

24、关系抗体固定技术：共价键合法、物理吸附法、聚合物静电/物理包埋法 第50页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.4.1 生物素-（链霉）亲和素相互作用 生物素-亲和素系统 (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。多级放大效应-灵敏生物素与亲和素之间高度亲和力-特异稳定适用性强（与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合）第51页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四图4.5两种免疫传感器的示意图：（a）基于生物素-链霉亲和素相互作用的免疫传感器；(b)基于兔IgG修

25、饰的SPCE的免疫传感器。 兔抗鼠抗体鼠抗体第52页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四利用蛋白A-环氧石墨生物复合体进行免疫分析，激光诱导荧光显微镜检测RIgG。第53页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.4.2 抗体结合蛋白质 细菌抗体结合蛋白质是免疫分析中另一种基于亲和作用的抗体固定技术，最常用的是蛋白质A和蛋白质G。特异地与抗体的非抗原结合区域（Fc）作用，使抗体的抗原结合位点远离固定相表面，易于与待测物反应。均可以直接与抗体的Fc部位结合，不需要对抗体进行生物素化修饰。蛋白质A的分子量约为42 kDa，最初是从金黄色葡萄球菌（staph

26、ylococcus aureus）的细胞壁中分离出的。 第54页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四图4.6以蛋白质A-GBE为转换器的免疫传感器示意图。（a）通过与蛋白质A作用固定RIgG，（b）抗RIgG 抗体和生物素标记的抗RIgG 抗体的竞争免疫反应，（c）通过链霉亲和素-HRP标记酶，（d）电化学检测酶活性。 检测抗RIgG抗体的范围为2 pmol-10 pmol 第55页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四以蛋白质A修饰的石墨环氧树脂生物复合物（Protein A-GBE）为刚性支架，不但可以固定抗体，还可作为电化学信号的转换器。 生物复

27、合材料膜的制备：将石墨粉与环氧树脂按质量比14的比例混合，再加入蛋白质A使其最终浓度为2%（W/W），得糊状物。将糊状物装入带有电气插头的圆柱型模具，压实，保持一星期。通过在Al2O3纸上研磨抛光，形成光滑的镜面，使蛋白质A露于表面，蛋白质A-石墨环氧树脂膜还可以重复使用。 第56页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四5.4.3 导电聚合物 导电聚合物，如聚苯胺、聚吡咯、聚噻吩等，已广泛应用于免疫分析体系中捕获抗体的固定，可用于电流型、电位型及阻抗型免疫分析体系。导电聚合物可以在酶和电极表面之间提供一条电子转移通道，而不需要介质来传递电子。利用导电高分子容易实现“无试剂”

28、或“无标记”免疫传感器。利用导电聚合物固定抗体的方法通常是将抗体包埋于聚合链中。利用含有抗体的单体溶液，抗体和聚合物可以同时固定在传感器表面。然而包埋法可能使抗体变性，失去活性。而且大部分的抗体包埋于聚合物基底中，不能与抗原结合。另一种方法是先将导电聚合物膜修饰到电极上，利用其活性基团共价键合抗体。 第57页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四图4.7基于TTCA膜的电极制备及信号产生示意图 Darain等报道了一种基于聚(三噻吩羧酸酯)（TTCA）修饰丝网印刷碳阵列（SPCA）的电流型免疫传感器，用于检测前体蛋白卵黄原蛋白（Vtg）。 竞争免疫分析第58页，共166页，

29、2022年，5月20日，13点51分，星期四4.4.4自组装单层膜 自组装单层膜（SAMs）是免疫分析体系中另一种抗体固定方法。利用烷烃硫醇与Au、Ag等金属的固有化学吸附性可形成高度有序的单层膜。Au电极由于不受周围环境影响发生氧化反应而常被用作工作电极。 第59页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四首先烷烃硫醇通过Au-S键在Au电极表面形成烷烃硫醇自组装单层膜。目前被普遍接受的解释Au-S键形成的模式是，第一步S-H键氧化加成到Au表面，还原消除氢，见方程（2）所示。图4.8烷烃硫醇链在SAM修饰的金电极表面形成的20-30倾斜角的示意图 -碳取代的烷烃硫醇形成的S

30、AM表面包含游离的羧基，活化后可与捕获抗体或其它蛋白质的赖氨酸上的氨基共价结合。 第60页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四抗体除了可以通过共价键结合到SAM上，还可以通过静电作用结合到带电的SAM膜上。 IgG通过“头部”吸附到带有-COOH的SAM上，而以“尾部”和“侧面”两种方式吸附到带有-NH2端基的SAM上。 S. Chen, L. Liu, J. Zhou, Langmuir, 2003, 19, 2859-2864研究了不同表面和溶液性质对抗体吸附排列方式的影响 第61页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四5.4.5抗体片段 抗体的片

31、段化可以通过糜蛋白酶、胰岛素、木瓜蛋白酶等蛋白水解酶催化完成。酶降解后，用以连接所生成的两条F(ab)2链的二硫键可以被二硫苏糖醇或-巯基乙胺等试剂还原，而生成两个Fab片段。每个片段末端都带有硫基，所以与金表面有很高的亲和性，不需另外加试剂就可自组装到金表面。形成的SAM呈有序排列，抗原结合区域很容易与抗原结合。 L链L链H链H链N端C端第62页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四Zhang和Meyerhoff报道了一种基于Fab片段固定于包被金的磁性粒子上的免疫分析方法，用于检测C活性蛋白（CRP）Anal. Chem. 2006, 78, 609-616甲苯磺酰基第

32、63页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四Figure 2. SEM images of (A) M-500 (4.5-m diameter) uncoated magnetic particles and (B) gold-coated M-500 magnetic particles.第64页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四将包被金的磁珠与抗CRP Fab片段于4 C孵育过夜，抗CRP Fab片段固定于磁珠表面，然后与不同的CRP反应，以吸光度对CRP浓度做工作曲线，检测限可达到0.14 ng mL-1。通过Fab片段上的氨基与未包被的磁珠发

33、生甲苯磺酰基反应共价键合的，检测限为1.9 ng mL-1。 第65页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.5 化学发光检测技术发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。 第66页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四請你們猜一道謎題：夜晚不休息，提燈四處巡，明滅草叢間，好似點點星。猜一種昆蟲螢火蟲公佈謎底螢火蟲為什麼會發光？是由身體哪個部位發光的？吃什麼東西？哪個地方看得到螢火蟲？這些問題，在接下來的投影片中都有提到，請仔細聆聽喔！START第67页，共166页，2022年，5月20日，

34、13点51分，星期四萤火虫发光雄螢雌螢身形較大第68页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四神奇的海底你知道吗？海面上波涛汹涌的时候，海底依然很宁静。最大的风浪，也只能影响到海面一下几十米深。阳光射不到海底，水越深光线越暗。五百米以下就全黑了。 在这片黑暗的深海粒，却有许多光点像闪烁的星星，那是有发光器的深海鱼在游动。 海底真是个景色奇异，物产丰富的世界。海底剪辑点击海底剪辑，会让你一饱眼福！美丽的图片深海鱼发光第69页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四神奇的海底海 底 动 物第70页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四发光分类

35、光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。生物发光：反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。化学发光根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:第71页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四化学发光Chemiluminescence (CL) 化学发光是指在某些特殊的化学反应中，反应的中间体或产物由于吸收了反应释放的化学能而处于电子激发态，当其回到基态时伴随产生的光辐射现象。第72页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四 化学发光反应包括两个关键步

36、骤，即化学激发和发光。化学发光反应能级图第73页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四 一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下： A十B C* C* C h其中为光子，C*表示C处于单线激发态。 第74页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下： A十B C* C*十D C十D* D* D十h第75

37、页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四化学发光分析根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或反应的发光总量来确定反应中相应组分含量的分析方法，称为化学发光分析。第76页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四化学发光分析优点化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，就避免了荧光分析中激发光杂散光的影响，有很高的灵敏度，并且不象放射分析那样存在强烈的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定量分析方法。第77页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四化学发光分析缺点虽然化学发光具备很高的特异性和很小的干扰，但化学分析本身的不特异性，制约了整个方

38、法的使用。第78页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四化学发光免疫分析chemiluminescence immunoassay（ CLIA）CLIA是将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。这种方法兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性。 第79页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四化学发光免疫分析（ CLIA）分类按分离方法不同分微粒子化学发光免疫测定磁颗粒化学发光免疫测定第80页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四 在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发

39、光剂或发光底物。 4.5.1 化学发光剂第81页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四能作为化学发光剂的条件：发光的量子产率高；它的物理-化学特性要与被标记或测定的 物质相匹配；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物； 其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。第82页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四 直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。 第83页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四 1. 吖啶酯

40、 在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。 第84页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四2三联吡啶钌 三联吡啶钌 RU(bpy)32+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。 三联吡啶钌第85页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四 酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底 物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。 1鲁米诺及其衍生物 2AMPPD第86页，共166页，2022年，5

41、月20日，13点51分，星期四1鲁米诺图4.9 鲁米诺发光原理第87页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四图4.10 鲁米诺增强发光反应原理 第88页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四2AMPPD3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷第89页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四1. 碳二亚胺（EDC）缩合法 4.5.2 发光剂的标记技术第90页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四2. 过碘酸钠氧化法 第91页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星

42、期四3重氮盐偶联法 第92页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法 第93页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四 1发光剂的选择 2被标记蛋白质的性质 3标记方法的选择 4原料比 5标记率 6温度 7纯化与保存 影响标记的因素第94页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四 用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。 由集光器和

43、光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。4.5.3直接化学发光免疫分析第95页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四发光YYY磁微粒被测抗原+抗体+带丫啶酯标记物抗体YYYYYYYYYYY冲洗后- 夹心法（1）加入H2O2（pH10）直接化学发光的机理第96页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四磁微粒模式图YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特点抗原和抗体结合与未结合部分易分离磁微粒技术第97页，共166页，2022年，5月20日，13点51

44、分，星期四 化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。4.5.4 化学发光酶免疫分析第98页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四该分析系统采用辣根过氧化

45、物酶（HRP）标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析第99页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四图4.11 辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 第100页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷

46、酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析第101页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四图4.12 碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图 第102页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四分析步骤分配样品,磁颗粒和试剂孵育使反应物结合在磁场中清洗去除未结合物质加入底物产生信号孵育,促使信号的产生信号检测第103页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.6 电致化学发光（ECL)电致化学发光 (ECL) 是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现

47、象。第104页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四电致化学发光（ECL)ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。因此ECL反应易精确控制，具有灵活性。第105页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.6.1 电化学发光剂定义：指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。特点反应在电极进行化学发光剂：三联吡啶钌电子供体为：三丙胺（TPA）第106页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四三联毗啶钌分子结构图第107页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四三联吡啶钌（ Ru

48、(bpy)32+ ）特点ECL分析中采用Ru(bpy)32+作为标记物，其活化衍生物是Ru(bpy)32+N羟基琥珀酸胺酯（NHS） ，该衍生物具有水溶性，且高度稳定，保证电化学发光反应的高效和稳定，而且避免了本底噪声的干扰。第108页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四三联吡啶钌（ Ru(bpy)32+ ）特点Ru(bpy)32+衍生物与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性；Ru(bpy)32+分子量小，空间位阻小 ，即便小分子的核酸也能标记，使检测的菜单大大丰富，更重要的是为其检测菜单的开发前景提供了广阔空间。第109页，共166页，2022

49、年，5月20日，13点51分，星期四电化学发光原理图基态激发态不稳定二丙胺+丙醛第110页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.6.2 电化学发光免疫分析(Electro-Chemiluminescence Immunoassay, ECLI)ECLI是继EIA、RIA、FIA、时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后的新一代标记免疫测定技术； ECLI是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物；ECLI是目前最先进的标记免疫测定技术之一。 第111页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四ECLI原理在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，用电化

50、学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。第112页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四图4.13 电化学发光免疫分析示意图第113页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四图4.14 电化学发光免疫测定示意图第114页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四图4.15 标记磁颗粒在电场中发光工作示意图第115页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四ECLIA检测流程图一（双抗体夹心的形成）第116页，共166

51、页，2022年，5月20日，13点51分，星期四ECLIA检测流程图二 （生物素与亲和素结合）第117页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四ECLIA体系结构图第118页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四ECLIA检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面）第119页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四ECLIA检测流程图四 （电极充电启动电化学反应）第120页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四ECLIA检测流程图五 （撤消磁场冲洗磁珠）第121页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四方

52、法评价采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8 m的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积比板式扩大2030倍，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度大大加快；第122页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四方法评价“链霉亲和素-生物素”是具有很强的非共价相互作用的一对化合物，具有牢固而特异的结合，应用此放大系统，使检测的灵敏度大大提高；第123页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四方法评价利用氧化铁的磁性，使用电磁场分离结合态和游离态，方便迅速，实现了精确的全自动化；标记物的再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定。第124页，

53、共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四基于CdS 量子点-CNT-AuNP-壳聚糖的电致化学发光免疫传感器研究第125页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四PDCNT：聚乙二胺-CNT第126页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四Fig. 1. (A) ECL-time curves of (a) PDCNTs/Au electrode, (b) CdS QDs/Au electrode, and (c) CdS QDs-PDCNTs/Au electrode. (B) ECLpotential curve and cyclic v

54、oltammogram (inset) of CdS QDs-PDCNTs/Au electrode (PMT: 600 V).第127页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四ECLpotential curves of (a) PDCNTs, (b) (a) + CdS QDs, (c) (b) + GNPs-CHIT, (d) (c) + Ab, and (e) (d) + HIgG modified Au electrodes (PMT: 600 V), and ECL emission from the immunosensor for 34 cycles (ins

55、et) (PMT: 800 V).第128页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四Representative SEM images of (A) PDCNTs, (B) (A) + CdS QDs, (C) (B) + GNPs-CHIT, (D) (C) + Ab modified Au electrodes.第129页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四Fig. 3. ECL responses of the immunosensor with different concentrations of HIgG (ah). HIgG concent

56、ration (ng mL-1): (a) 0, (b) 0.006, (c) 0.06, (d) 0.6, (e) 3, (f) 6, (g) 60, and (h) 150. (Inset) Calibration curve for HIgG determination.第130页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四ELIA优越性高度敏感，可达pgml或pmol水平；特异性强，重复性好，CV5。测定范围宽，可达7个数量级。试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长，达数月甚至数年。操作简单，耗时短，易于自动化。在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。第131

57、页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四临床应用激素肿瘤标记物内分泌功能传染性疾病其它如VB12、叶酸、铁蛋白、肌钙蛋白、肌红蛋白、酶、脂肪酸、维生素和药物等多种检测项目。第132页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.7 电化学检测技术 电化学检测由于其自身的优点常用于生物传感器研究，成为免疫传感器中研究最早、种类最多、也较为成熟的一个分支。 电化学转换的高灵敏性易与现代微型化/微加工技术兼容较低的能源需求不受样品的浊度及颜色的影响 第133页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四电化学免疫传感器的基本工作原理是：采用电化学检测

58、方法来检测标记的免疫试剂或者一些由酶、金属离子和其他电活性物质标记的标记物，从而对疾病诊断或病人状态监测中复杂体系的多组分混合物进行分析，提供有力数据。 根据信号的类型可分为电位法、电流法、伏安法以及最近发展的电化学阻抗检测 第134页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.7.1 电位型免疫传感器 电位型免疫传感器是基于测量抗体、抗原免疫反应后指示剂与参比电极之间的电位变化来进行免疫分析的。有关基于电位检测的免疫传感器的研究报道较少该检测方法一个主要的缺点就是抗体-抗原发生免疫分析后电位变化不大。而且，样品基底的干扰会使这种小的信号变化难以准确检测，所以电位型传感器的可

59、靠性及灵敏性较差。 第135页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四一种电位型免疫传感器，在聚吡咯修饰的丝网印刷电极表面检测酶标免疫复合物首先在含有吡咯单体和十二烷基硫酸钠的溶液中，进行循环伏安扫描至少4次，形成电聚合膜修饰电极。然后在电极上加一恒电位使聚吡咯膜达到其最终状态。所形成的聚吡咯膜修饰电极在37C时可以保存4个月，而且显示良好的灵敏性。 捕获抗体可以通过直接吸附作用固定在聚吡咯膜上，也可以将生物素修饰的抗体结合到链霉亲和素修饰的聚吡咯膜上。然后将电极与含有乙肝表面抗原或心肌肌钙蛋白I的样品溶液孵育，再加入HRP标记的抗体进行夹心式免疫分析。加入活性底物二氯邻苯二

60、胺60 s后，在0.01 M PBS（pH 7.4）中进行电位检测，记录电位。 第136页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四4.7.2 电流型免疫传感器 电流检测中，在恒电压下电活性分析物在电极上产生的氧化或还原电流强弱与待测物浓度成正比。由于抗体和抗原本身并没有电化学活性，所以在免疫传感器中需要在免疫复合物中引入合适的标记来形成电化学反应。在这方面，标记酶，包括氧化还原酶、HRP和水解酶AP，由于它们能催化底物生成电活性产物而经常被用到，产物的氧化还原电流与待测物的浓度成正比。 第137页，共166页，2022年，5月20日，13点51分，星期四AP催化它的底物4-氨