复和修复医学知识宣讲课件

1、I consider molecular biology to be the study of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA replication, recombination and translocation.Molecular Biology - Robert Weaver1复和修复医学知识宣讲10/4/2022I consider molecular biology t分子生物学在分子水平上研究核酸与蛋白质的功能1. 基因组在细胞

2、和世代中的维持DNA的复制、修复和重组2. 基因的表达与调控基因的转录和翻译、蛋白质的修饰，原核与真核基因表达调控3. 基因表达与细胞信号的偶联 4. 分子生物学技术及其应用DNA操作技术、基因工程、基因诊断、基因治疗2复和修复医学知识宣讲10/4/2022分子生物学在分子水平上研究1. 基因组在细胞和世代中的维持2分子生物学发展简史奠基时代（18691952） 物理学与生物学的融合 遗传物质化学本质（DNA）的确定黄金时代（19531972） DNA双螺旋结构和复制机制的发现 分子生物学所有基本原理于此诞生基因工程时代（1973今） 基因工程的诞生与发展 分子生物学技术进入生命科学所有领域

3、迈向“组学”时代（2000 ）3复和修复医学知识宣讲10/4/2022分子生物学发展简史奠基时代（18691952）3复和修复医兼顾“假说导向”与“发现导向” 的科学研究方法实验室为主体规模化平台组合策略性强战略性强常规投入、随时启动持续投入、长期规划总费用低、单位费用高总费用高、单位费用低研究形式为假说驱动为主研究形式为发现驱动为主科学前沿问题科学前沿重大方向性问题规范管理机制创新管理机制依赖领军科学家依赖团队主学科聚焦多学科交叉实验技术组合技术平台组合依赖技术积累依赖技术更新4复和修复医学知识宣讲10/4/2022兼顾“假说导向”与“发现导向” 的科学研究方法实验室为主体规医学分子生物学的

4、研究主题是健康与疾病的分子机制人类发育调控和功能调控的分子基础疾病的分子机制生物工程与生物制药预防医学基因诊断与基因治疗5复和修复医学知识宣讲10/4/2022医学分子生物学的研究主题是健康与疾病的分子机制人类发育调控和分子生物学在医学领域的应用用基因敲除技术探讨发育的分子机制6复和修复医学知识宣讲10/4/2022分子生物学在医学领域的应用用基因敲除技术探讨发育的分子机制6单个抑癌基因的突变即可导致肿瘤的发生7复和修复医学知识宣讲10/4/2022单个抑癌基因的突变即可导致肿瘤的发生7复和修复医学知识宣讲1重组蛋白技术用于药物生产8复和修复医学知识宣讲10/4/2022重组蛋白技术用于药物生

5、产8复和修复医学知识宣讲10/2/20这些金色的转基因大米里含有 b-胡萝卜素,食用这种大米可以预防维生素A缺乏症。9复和修复医学知识宣讲10/4/2022这些金色的转基因大米里含有 b-胡萝卜素,9复和修复医学知识RFLP技术在法医学中的应用DefendantsbloodBlood fromdefendantsclothesVictimsblood10复和修复医学知识宣讲10/4/2022RFLP技术在法医学中的应用Defendantsbloo DNA的合成及重组 DNA Biosynthesis and Recombination第十六章11复和修复医学知识宣讲10/4/2022 DNA的

6、合成及重组第十六章11DNA生物合成DNA复制（DNA指导的DNA合成）逆转录 (逆转录病毒RNA指导的DNA合成)校正复制中可能出现的错误，并修复受到损伤的DNA细胞中酶促修复系统自然界DNA重组和基因转移的基本方式12复和修复医学知识宣讲10/4/2022DNA生物合成DNA复制（DNA指导的DNA合成）逆转录 基因组复制的主要特点The General features of Genome Replication 第一节13复和修复医学知识宣讲10/4/2022基因组复制的主要特点第一节13复和修复医学知识宣讲10/2/一、基因组是细胞或病毒全部遗传信息的总和 含有一种生物的一整套遗传信

7、息的遗传物质，称为基因组（genome）。在真核生物体中，基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列。14复和修复医学知识宣讲10/4/2022一、基因组是细胞或病毒全部遗传信息的总和 含有一种生物的一整核基因组线粒体基因组人类基因组包括15复和修复医学知识宣讲10/4/2022核基因组线粒体基因组人类基因组包括15复和修复医学知识宣人类基因组（Genome）人类基因组包含22条常染色体和X、Y两条性染色体上的遗传物质（核基因组）和线粒体的遗传物质（线粒体基因组）。16复和修复医学知识宣讲10/4/2022人类基因组（Genome）16复和修复医学知识宣讲10/2/

8、人类染色体的RxFISH图谱17复和修复医学知识宣讲10/4/2022人类染色体的RxFISH图谱17复和修复医学知识宣讲10/2基因假基因重复序列人类基因组7号染色体-TCR基因座的某50kb区域基因片段18复和修复医学知识宣讲10/4/2022基因假基因重复序列人类基因组7号染色体-TCR基因座的某5全长16,569bp，含37个基因。其中13个基因编码蛋白质，其余24个编码rRNA和tRNA。人线粒体基因组图谱19复和修复医学知识宣讲10/4/2022全长16,569bp，含37个基因。人线粒体基因组图谱19复人类基因组各成分所占比例20复和修复医学知识宣讲10/4/2022人类基因组各

9、成分所占比例20复和修复医学知识宣讲10/2/2二、基因组DNA复制具备一些共同特征复制是半保留的在复制的生长点形成复制叉复制是双向的复制是半不连续的复制起点由多个短重复序列组成DNA的复制必须有引物复制需要多种酶和蛋白因子的参与基因组复制是高保真的21复和修复医学知识宣讲10/4/2022二、基因组DNA复制具备一些共同特征复制是半保留的21复和修1. DNA复制是半保留复制DNA双螺旋中的每一条链都作为合成互补链的模板，其结果就使得两条子代的双螺旋都和母本完全一致。22复和修复医学知识宣讲10/4/20221. DNA复制是半保留复制DNA双螺旋中的每一条链都作为合Meselson-Sta

10、hl实验23复和修复医学知识宣讲10/4/2022Meselson-Stahl实验23复和修复医学知识宣讲102. DNA复制的生长点形成复制叉复制叉复制叉复制泡复制起点24复和修复医学知识宣讲10/4/20222. DNA复制的生长点形成复制叉复制叉复制叉复制泡复制起点3. DNA复制是双向复制25复和修复医学知识宣讲10/4/20223. DNA复制是双向复制25复和修复医学知识宣讲10/2/4. DNA复制是半不连续复制冈崎片段26复和修复医学知识宣讲10/4/20224. DNA复制是半不连续复制冈崎片段26复和修复医学知识宣两个原因造成了DNA的半不连续复制：DNA双链是反向平行的；

11、DNA合成的方向只能是5-3。在一条模板上，DNA能进行连续的合成，DNA聚合酶简单地尾随着复制叉，此模板所指导合成的新DNA链称为前导链。在另一条模板上，DNA聚合酶与复制叉做反向运动，此模板指导合成的是后随链。后随链上形成的新链DNA片段，称为冈崎片段。27复和修复医学知识宣讲10/4/2022两个原因造成了DNA的半不连续复制：27复和修复医学知识宣讲5. 复制起点有特殊的结构复制的起始并非一个随机的过程，它总是在DNA分子上的同一个或多个位置开始的，这些位点被称为复制起始点（Origin of Replication）。环状的细菌基因组只有一个复制起点，这意味着每一个复制叉要复制几千k

12、b的DNA。酿酒酵母约有300个复制起点，每一个起点对应40kb；而人类有20,000个起点，每个起点对应约150kb的DNA。28复和修复医学知识宣讲10/4/20225. 复制起点有特殊的结构复制的起始并非一个随机的过程，它总 GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列 反向重复序列5353E.coli复制起始点 oriC29复和修复医学知识宣讲10/4/2022 GA

13、TTNTTTATTT GATCTNTTNTAT真核生物有多个复制起始点酿酒酵母的第三号染色体是已知最小的真核生物染色体，它包含180个基因和 9 个复制起点。30复和修复医学知识宣讲10/4/2022真核生物有多个复制起始点酿酒酵母的第三号染色体是已知最小的真真核生物复制起始点的结构复制起点（OBR）由一些短重复序列组成。酵母OBR结构已被阐明，哺乳动物OBR精细结构尚在研究中。结合OBR并启动复制的蛋白复合物称为复制起点复合物（ORC）。31复和修复医学知识宣讲10/4/2022真核生物复制起始点的结构复制起点（OBR）由一些短重复序列组6. DNA复制需要引物多数DNA复制使用新合成的短R

14、NA引物。个别DNA复制以DNA、tRNA或蛋白质做引物。32复和修复医学知识宣讲10/4/20226. DNA复制需要引物多数DNA复制使用新合成的短RNA引7. 复制需要多种酶和蛋白因子的参与原核生物真核生物引物酶DnaGDNA聚合酶 DNA解螺旋酶DnaBMcm2-7SSBSSBRPA拓扑异构酶拓扑异构酶II拓扑异构酶I、II33复和修复医学知识宣讲10/4/20227. 复制需要多种酶和蛋白因子的参与原核生物真核生物引物酶D8. 基因组复制是高保真的 DNA聚合酶每添加105个核苷酸中，仅掺入一个不正确的核苷酸；校正外切核酸酶使不正确配对的的概率降低到10-7；错配修复系统使最终的出错

15、机率降低到10-10。这相当于每复制1000个细菌基因组，仅出现一个错误的核苷酸。34复和修复医学知识宣讲10/4/20228. 基因组复制是高保真的 DNA聚合酶每添加105个核苷酸三、不同基因组DNA通过不同的模式 进行复制（一）真核生物基因组DNA复制过程涉及反转录 （端粒的复制）（二）单链DNA病毒基因组通过复制中间体复制 （三）HBV基因组通过RNA中间体进行复制 （四）双链环状DNA也有不同的复制方式 35复和修复医学知识宣讲10/4/2022三、不同基因组DNA通过不同的模式 进行复制DNA复制过程Process of DNA Replication第二节36复和修复医学知识宣讲

16、10/4/2022DNA复制过程第二节36复和修复医学知识宣讲10/2/202一、细菌的DNA复制复制的起始复制叉上的DNA复制复制的终止37复和修复医学知识宣讲10/4/2022一、细菌的DNA复制复制的起始复制叉上的DNA复制复制的终止E.coli 复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列 反向重复序列535338复和修复医学知识宣讲10/4/2

17、022E.coli 复制起始点 oriC GATTNTTTATTTE.coli DNA复制起始和复制叉的形成 39复和修复医学知识宣讲10/4/2022E.coli DNA复制起始和复制叉的形成 39复和修复医学在E.coli复制起始过程中，DnaA、DnaB/C（解螺旋酶）、DnaG（引物酶）和DNA聚合酶III依次加入，形成最初的复制叉。DNA聚合酶催化的复制反应复制叉上的DNA合成40复和修复医学知识宣讲10/4/2022在E.coli复制起始过程中，DnaA、DnaB/C（解螺旋（一）DNA聚合酶催化的复制反应41复和修复医学知识宣讲10/4/2022（一）DNA聚合酶催化的复制反应4

18、1复和修复医学知识宣讲10DNA复制反应的底物是dNTP和引物-模板连接处反应由DNA聚合酶催化42复和修复医学知识宣讲10/4/2022DNA复制反应的底物是反应由DNA聚合酶催化42复和修复医学聚合酶活性中心外切核酸酶活性中心所有的DNA聚合酶都有相似的空间结构43复和修复医学知识宣讲10/4/2022聚合酶外切核酸酶所有的DNA聚合酶都有相似的空间结构43复和与DNA聚合酶结合的金属离子催化核苷酸的添加44复和修复医学知识宣讲10/4/2022与DNA聚合酶结合的金属离子催化核苷酸的添加44复和修复医学DNA聚合酶能分辨正确与错误的碱基45复和修复医学知识宣讲10/4/2022DNA聚合

19、酶能分辨正确与错误的碱基45复和修复医学知识宣讲1DNA聚合酶能分辨dNTP与NTP46复和修复医学知识宣讲10/4/2022DNA聚合酶能分辨dNTP与NTP46复和修复医学知识宣讲1DNA聚合酶具有延伸能力DNA聚合酶的延伸能力（processivity）定义为每次酶与引物-模板接头结合时所添加核苷酸的平均数；每种DNA聚合酶都有其特征性的延伸能力，从几个到50000个核苷酸不等；DNA聚合酶与完全包围DNA的“滑动夹”蛋白之间的相互作用，可进一步提高延伸能力。47复和修复医学知识宣讲10/4/2022DNA聚合酶具有延伸能力DNA聚合酶的延伸能力（proces外切核酸酶活性校正新合成的D

20、NA影响DNA聚合酶精确度的主要因素是碱基变成“错误”的互变异构体（亚氨基或烯醇基）；错配的核苷酸激活3-5外切核酸酶活性；错配核苷酸去除后，构象恢复，DNA聚合反应继续进行。48复和修复医学知识宣讲10/4/2022外切核酸酶活性校正新合成的DNA影响DNA聚合酶精确度的主要（二）复制叉上的DNA合成前面我们讨论了引物-模板接头处DNA的合成，然而在细胞内，DNA的双链是同时复制的。这就必须解决：半不连续复制；RNA引物的合成和去除；解开复制叉及相关的拓扑学问题。49复和修复医学知识宣讲10/4/2022（二）复制叉上的DNA合成前面我们讨论了引物-模板接头处DN复制叉上DNA的合成是半不连

21、续的前导链后随链合成方向与解链方向相同合成方向与解链方向相反50复和修复医学知识宣讲10/4/2022复制叉上DNA的合成是半不连续的前导链后随链合成方向与解链方RNA引物的合成与去除所有的DNA聚合酶都不能从头合成DNA链；RNA聚合酶具有从头合成核苷酸链的能力；细胞利用一种特殊的RNA聚合酶来启动复制：引物酶，能在单链DNA模板上合成5-10个核苷酸长度的短RNA引物，DNA聚合酶随后延伸这些引物。E.coli的引物酶是DnaG蛋白，真核生物的引物酶是DNA聚合酶的p48亚基。51复和修复医学知识宣讲10/4/2022RNA引物的合成与去除所有的DNA聚合酶都不能从头合成DNA原核与真核生

22、物RNA引物的合成聚合酶转换52复和修复医学知识宣讲10/4/2022原核与真核生物RNA引物的合成聚合酶转换52复和修复医学知识RNA引物的去除53复和修复医学知识宣讲10/4/2022RNA引物的去除53复和修复医学知识宣讲10/2/2022RNase H可去除DNA:RNA杂交链中的RNA；DNA聚合酶（ E.coli中是DNA聚合酶 I，真核生物中目前认为是DNA聚合酶 或 ）填补去除引物后留下的空隙（gap）；DNA连接酶连接两个相邻的核苷酸。54复和修复医学知识宣讲10/4/2022RNase H可去除DNA:RNA杂交链中的RNA；54复和在复制叉上有多种蛋白质协同解开双螺旋DN

23、A聚合酶本身不能解开双螺旋，因此还需要多种酶和蛋白因子的协同作用，它们完成以下三项任务：将DNA双螺旋分开以形成两条单链DNA模板；保证复制前单链DNA保持伸直状态；解决分开DNA双螺旋而引起的拓扑学问题。55复和修复医学知识宣讲10/4/2022在复制叉上有多种蛋白质协同解开双螺旋DNA聚合酶本身不能解开解螺旋酶解开DNA双螺旋DNA解螺旋酶通常是六聚体蛋白，环绕着DNA，因此有很高的延伸能力；解螺旋酶利用ATP的能量解开双螺旋；所有解螺旋酶都有极性（polarity），即特异性地结合DNA双链中的一条。56复和修复医学知识宣讲10/4/2022解螺旋酶解开DNA双螺旋DNA解螺旋酶通常是六

24、聚体蛋白，环绕E.coli的解螺旋酶是DnaB蛋白，它本身是六聚体，又与六个DnaC蛋白共同组成解螺旋复合物；人类的解螺旋酶目前认为是Mcm2-7复合物，同样是六聚体；DnaB解螺旋方向为5-3，即结合后随链的模板。57复和修复医学知识宣讲10/4/2022E.coli的解螺旋酶是DnaB蛋白，它本身是六聚体，又与六单链结合蛋白使单链DNA稳定DNA解螺旋酶打开双螺旋后，新生成的单链DNA必须保持碱基未配对的状态，直至成为模板。单链DNA结合蛋白（SSB）结合到单链DNA上，使单链模板保持伸直的状态。人类的单链结合蛋白是RPA蛋白，它是异三聚体，三个亚基分别是p70、p34、p11。58复和修

25、复医学知识宣讲10/4/2022单链结合蛋白使单链DNA稳定DNA解螺旋酶打开双螺旋后，新生59复和修复医学知识宣讲10/4/202259复和修复医学知识宣讲10/2/2022拓扑异构酶除去解螺旋时产生的超螺旋DNA复制中的拓扑学难题：在解链过程中伴随着DNA分子的旋转：双螺旋中每10bp形成一周；以人的1号染色体为例，1号染色体长250Mb，复制时就必须旋转2500万次； 细菌和噬菌体等环状基因组，则不可能以旋转的方式解螺旋。60复和修复医学知识宣讲10/4/2022拓扑异构酶除去解螺旋时产生的超螺旋DNA复制中的拓扑学难题：解链过程中正超螺旋的形成61复和修复医学知识宣讲10/4/2022

26、解链过程中正超螺旋的形成61复和修复医学知识宣讲10/2/2拓扑异构酶切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶的作用机制62复和修复医学知识宣讲10/4/2022拓扑异构酶切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结拓扑异构酶的作用机制拓扑异构酶切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。63复和修复医学知识宣讲10/4/2022拓扑异构酶的作用机制拓扑异构酶切断DNA分子两股链，断端通本图显示拓扑异构酶 II 除去由复制叉所产生的正超螺旋：通过“断裂-

27、再连接”的方式，将未复制的DNA的一部分通过未复制区域的断裂点以消除正超螺旋。该反应使连环数减少2，因此每复制20bp将会发生一次。64复和修复医学知识宣讲10/4/2022本图显示拓扑异构酶 II 除去由复制叉所产生的正超螺旋：64复制叉酶扩大了DNA聚合酶的底物范围DNA聚合酶本身只能延伸已合成的引物，但是引物酶、解螺旋酶和拓扑异构酶的加入极大地扩大了DNA聚合酶可能的底物范围：引物酶使得DNA聚合酶能复制任何单链DNA；DNA解螺旋酶和拓扑异构酶使得DNA聚合酶能复制任何双链DNA。 没有这些酶的参与，复制叉是不可想象的。65复和修复医学知识宣讲10/4/2022复制叉酶扩大了DNA聚合

28、酶的底物范围DNA聚合酶本身只能延伸66复和修复医学知识宣讲10/4/202266复和修复医学知识宣讲10/2/2022DNA聚合酶是高度特化的细胞内有多种DNA聚合酶，它们为执行不同的生物学功能而高度特化了：E.coli有5种DNA聚合酶，其中Pol III是复制酶；真核生物有超过10种DNA聚合酶，其中DNA聚合酶有引物酶活性，DNA聚合酶和是复制酶。 67复和修复医学知识宣讲10/4/2022DNA聚合酶是高度特化的细胞内有多种DNA聚合酶，它们为执行TLS1 Rev 1TLS，体细胞高变1Pol 相对准确的TLS（穿越环丁烷二聚体）1Pol TLS1Pol 体细胞高变（somatic

29、hypermutation）1Pol 减数分裂相关的DNA损伤修复1Pol TLS1Pol DNA交联损伤修复1Pol DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复4Pol DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复23Pol 线粒体DNA复制和损伤修复3Pol 碱基切除修复1Pol 合成引物4Pol 功能亚基数目真核生物TLS（translesion synthesis）3Pol (UmuC, UmuD)DNA损伤修复，穿越损伤合成（TLS）1Pol (Din B)染色体DNA复制9Pol 全酶染色体DNA复制3Pol 核心酶DNA损伤修复1Pol 去除RNA引物，DNA损伤修复1Pol 功能亚基

30、数目原核生物（E. coli）68复和修复医学知识宣讲10/4/2022TLS1 Rev 1TLS，体细胞高变1Pol 相对准确的延伸能力差，只能延伸20个核苷酸左右。功能：切除引物，填补冈崎片段间的空隙、DNA损伤的修复。DNA pol I（109kD）69复和修复医学知识宣讲10/4/2022延伸能力差，只能延伸20个核苷酸左右。DNA pol I69323个氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 604个氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性N 端C 端枯草杆菌蛋白酶DNA pol IKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。 70复和修

31、复医学知识宣讲10/4/2022323个氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段/Kl 2个核心酶（、 3种亚基） 1个复合物（、 6种亚基） 可滑动的DNA夹子（含1对-亚基）DNA聚合酶III的结构全酶结构包括：一次延伸达500000个核苷酸，催化速度达1000bp/s，有校对功能，是细菌复制延长中真正起催化作用的酶。 71复和修复医学知识宣讲10/4/2022 2个核心酶（、 3种亚基）DNA聚合酶III的亚基有聚合酶活性亚基有3-5校正核酸酶活性亚基协助核心酶固定在DNA模板上复合物连接两个核心酶72复和修复医学知识宣讲10/4/2022亚基有聚合酶活性72复和修复医学知识宣讲10/2/2

32、022细菌复制叉上DNA的合成（小结）复制叉上的前导链和后随链同时合成；DNA聚合酶III全酶同时复制DNA的双链；前导链迅速复制。后随链进行不连续的合成；引物酶、解螺旋酶、拓扑异构酶和SSB蛋白协助DNA聚合酶III完成复制过程。 以上统称“长号模型”。73复和修复医学知识宣讲10/4/2022细菌复制叉上DNA的合成（小结）复制叉上的前导链和后随链同时74复和修复医学知识宣讲10/4/202274复和修复医学知识宣讲10/2/202275复和修复医学知识宣讲10/4/202275复和修复医学知识宣讲10/2/2022E.coli基因组的复制终止E.coli基因组复制由oriC开始，到ter

33、终止；Tus蛋白识别复制终点使复制终止；复制完成还包括去除引物和连接冈崎片段；拓扑异构酶解开套在一起的两个DNA分子。76复和修复医学知识宣讲10/4/2022E.coli基因组的复制终止E.coli基因组复制由oriC复制受到DnaA-ATP水平和SeqA的调控E.coli基因组的oriC的GATC序列（双链）的A通常是甲基化的，只有甲基化的oriC可启动复制。新合成链oriC的GATC在未甲基化之前，可与SeqA蛋白结合，而丧失启动复制的能力；DnaA-ATP蛋白在复制过程中转变为DnaA-ADP，而丧失启动复制的能力；以上机制共同使E.coli在oriC的新拷贝上启动新一轮复制的能力显著

34、降低。77复和修复医学知识宣讲10/4/2022复制受到DnaA-ATP水平和SeqA的调控E.coli基因78复和修复医学知识宣讲10/4/202278复和修复医学知识宣讲10/2/2022虽然如此，但这并不意味着E.coli的oriC在一轮复制周期中就只起一次作用；E.coli每20分钟就分裂一次，而基因组的复制时间就需要40分钟，在快速生长期，基因组在上一轮复制完成之前就要启动下一轮复制，而使染色体上出现6个复制叉；所以，确切的说法是：每一轮细胞分裂只有一轮自oriC的复制起始。79复和修复医学知识宣讲10/4/2022虽然如此，但这并不意味着E.coli的oriC在一轮复制周期真核生物

35、复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶/转换；切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNase H和FEN1等。 二、真核生物的DNA复制真核生物与原核生物DNA复制的差异：80复和修复医学知识宣讲10/4/2022真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；二、真核生(一)常见的真核细胞DNA聚合酶有5种A家族与大肠杆菌Pol同源，包括Pol 和Pol B家族与大肠杆菌Pol 同源，包括Pol 、和C家族与大肠杆菌Pol 同源，仅在真菌中发现X家族与大肠杆菌DNA聚合酶并无同源性，却与末端转移酶同源，成员包括Pol 、Y家族（ UmuC/Din

36、B超家族），近年发现一个特殊的真核及原核DNA聚合酶家族，成员包括Pol 、和Rev181复和修复医学知识宣讲10/4/2022(一)常见的真核细胞DNA聚合酶有5种A家族与大肠杆菌PolPol 负责合成引物Pol 负责DNA复制、核苷酸切除修复和碱基切除修复Pol 的功能与Pol 相似（其确切功能尚待定）Pol 可能和碱基切除修复有关Pol 负责线粒体DNA复制和损伤修复常见的真核DNA聚合酶有5种：82复和修复医学知识宣讲10/4/2022Pol 负责合成引物常见的真核DNA聚合酶有5种：82复和拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前方产生的正超螺旋Tol和TolDNA

37、双螺旋解链，参与组装引发体DNA解旋酶连接冈崎片段DNA连接酶核酸酶，切除RNA引物RNase H核酸酶，切除RNA引物FEN1DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复Pol /合成RNA-DNA引物Pol /引发酶夹子装载器，促使PCNA结合于引物-模板链，有依赖DNA的ATPase活性，结合于引物-模板链，激活DNA聚合酶RFC可滑动的DNA夹子，激活DNA聚合酶和RFC的ATPase活性PCNA单链DNA结合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易结合DNARPA功 能蛋白质真核DNA复制叉主要蛋白质的功能(二)真核DNA复制叉主要蛋白质的类型和功能与原核基本相似83复和修复医学知识宣讲10

38、/4/2022拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前方DNA聚合酶（Pol ）分子含有4个亚基：1. DNA聚合酶/引发酶复合物合成RNA-DNA引物p180：催化亚基p48：具有引物酶活性p58：p48的稳定性和活性所必需的p70：与组装引发体有关84复和修复医学知识宣讲10/4/2022DNA聚合酶（Pol ）分子含有4个亚基：1. DNA聚功能：合成RNA引物反应过程：调节：磷酸化的调节作用Pol /引发酶复合物首先，合成RNA引物；其次，利用DNA聚合酶活性将引物延伸，产生起始DNA（initiator DNA，iDNA）短序列，形成RNA-DNA引物；最后，Pol

39、 /引发酶脱离模板链DNA，发生DNA聚合酶转换（switch）。85复和修复医学知识宣讲10/4/2022功能：合成RNA引物Pol /引发酶复合物首先，合成RNA原核与真核生物RNA引物的合成聚合酶转换86复和修复医学知识宣讲10/4/2022原核与真核生物RNA引物的合成聚合酶转换86复和修复医学知识结构： p70、p34和p11组成异源三聚体功能： 2. RPA的功能与E.coli的SSB相似复制蛋白A（replication protein A，RPA）结合单链DNA促使双螺旋DNA解旋激活Pol /引发酶活性为Pol 依赖复制因子C（RFC）和增殖细胞核抗原（PCNA）合成DNA所

40、必需RPA三聚体与SV40 T抗原结合，组装引发体复合物所必需RPA参与DNA重组和修复87复和修复医学知识宣讲10/4/2022结构： p70、p34和p11组成异源三聚体2. RPA的功p140 结合PCNAp40、p37和p36组成稳定的核心复合物，具有依赖DNA的ATPase活性p38可能在p140和核心复合物之间起连接作用3. RFC与E.coli DNA聚合酶的-复合物功能相似复制因子C（replication factor C，RFC）结构：有p140，p40，p38，p37、p36 5个亚基88复和修复医学知识宣讲10/4/2022p140 结合PCNA3. RFC与E.col

41、i DNA聚合促使可滑动的DNA夹子PCNA结合于引物-模板链，是Pol 在模板DNA链上组装并形成具有持续合成能力全酶所必需的。RFC的功能：89复和修复医学知识宣讲10/4/2022促使可滑动的DNA夹子PCNA结合于引物-模板链，是Pol PCNA是Pol 的进行性因子，使Pol 获得持续合成能力。PCNA是协调DNA复制、损伤修复、表观遗传和细胞周期调控的核心因子。PCNA水平是检测细胞增殖的重要指标。PCNA能激活Pol 。4. PCNA是可滑动的DNA夹子增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）结构：功能：同源三聚体，可形成闭

42、合环形的可滑动DNA夹子。90复和修复医学知识宣讲10/4/2022PCNA是Pol 的进行性因子，使Pol 获得持续合成能不同生物的夹子结构相似E.coli的亚基二聚体 T4噬菌体 PCNA蛋白三聚体 gp45蛋白三聚体91复和修复医学知识宣讲10/4/2022不同生物的夹子结构相似E.coli的亚基二聚体 p125：催化亚基，具有DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性，其N端区与PCNA相互作用p50：辅助PCNA激活p1255. DNA聚合酶合成前导链和后随链结构：Pol 分子是异源二聚体（p125和p50）功能：Pol 合成前导链和后随链DNA聚合酶92复和修复医学知识宣讲10/4/20

43、22p125：催化亚基，具有DNA聚合酶活性和35核酸外切FEN1（flap endonuclease 1）具有核酸内切酶和53核酸外切酶活性。FEN1参与去除冈崎片段5端的RNA引物。6. FEN1和RNAse H切除RNA引物93复和修复医学知识宣讲10/4/2022FEN1（flap endonuclease 1）具有核酸内DNA复制需要DNA解旋酶Mcm2-7打开DNA双螺旋，使复制模板链得以暴露。7. DNA解旋酶打开双螺旋以暴露复制模板94复和修复医学知识宣讲10/4/2022DNA复制需要DNA解旋酶Mcm2-7打开DNA双螺旋，使复8. 真核复制叉有1个Pol 和2个Pol 复

44、合物真核DNA复制叉模型95复和修复医学知识宣讲10/4/20228. 真核复制叉有1个Pol 和2个Pol 复合物真核D(三) 引发和延伸发生DNA聚合酶/转换识别染色体DNA复制起点和DNA局部解旋后，Pol /引发酶复合物结合于复制起点，这一步叫做引发体组装。引发体组装包括DNA解旋酶与Pol /引发酶相互作用。1. 解旋酶与Pol /引发酶相互作用组装引发体96复和修复医学知识宣讲10/4/2022(三) 引发和延伸发生DNA聚合酶/转换识别染色体DNA前导链：出现在引发后期后随链：发生于每个冈崎片段合成之际发生DNA聚合酶/转换的原因是Pol 不具备持续合成能力DNA聚合酶/转换的关

45、键蛋白是RFC2. DNA聚合酶/转换97复和修复医学知识宣讲10/4/2022前导链：出现在引发后期2. DNA聚合酶/转换97复和修真核DNA聚合酶转换和后随链合成98复和修复医学知识宣讲10/4/2022真核DNA聚合酶转换和后随链合成98复和修复医学知识宣讲10(四) 切除RNA引物有两种机制RNAse H/FEN1Dna2/FEN199复和修复医学知识宣讲10/4/2022(四) 切除RNA引物有两种机制RNAse H/FEN1D(五) 真核染色体在每个细胞周期只能复制一次真核基因组复制仅发生在 S 期，在此期间，所有的DNA都必须且只能复制一次，这意味着所有的复制器都仅被利用一次；

46、真核生物的复制起始子是复制起点识别复合物（ORC），它募集相关蛋白因子，形成前复制复合体（pre-RC）；对pre-RC形成和激活的调控使每个细胞周期内仅有一轮复制发生。100复和修复医学知识宣讲10/4/2022(五) 真核染色体在每个细胞周期只能复制一次真核基因组复制仅真核细胞的细胞周期101复和修复医学知识宣讲10/4/2022真核细胞的细胞周期101复和修复医学知识宣讲10/2/202pre-RC的形成ORC是起始子；Cdc6和Cdt1是解旋酶装载蛋白；Mcm2-7是解螺旋酶。pre-RC虽然只在G1期形成，但只在S期才激活。102复和修复医学知识宣讲10/4/2022pre-RC的形

47、成ORC是起始子；102复和修复医学知识宣讲对pre-RC的调控使得每个细胞周期只有一轮复制103复和修复医学知识宣讲10/4/2022对pre-RC的调控使得每个细胞周期只有一轮复制103复和修104复和修复医学知识宣讲10/4/2022104复和修复医学知识宣讲10/2/2022(六)端粒酶确保染色体末端复制完整 前导链产生完整的子染色单体。后随链3端留下缩短的未复制的ssDNA区。105复和修复医学知识宣讲10/4/2022(六)端粒酶确保染色体末端复制完整 前导链产生完整的子染色单端粒（telomeres）由富含TG的重复序列组成。人的端粒重复序列为5-TTAGGG-3。这些重复序列多

48、为双链，但每个染色体的3端比5端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题。106复和修复医学知识宣讲10/4/2022端粒（telomeres）由富含TG的重复序列组成。106复端粒酶的结构107复和修复医学知识宣讲10/4/2022端粒酶的结构107复和修复医学知识宣讲10/2/2022端粒延长机制（爬行模型）108复和修复医学知识宣讲10/4/2022端粒延长机制（爬行模型）108复和修复医学知识宣讲10/2/端粒酶对端粒3端的延长解决了末端复制109复和修复医学知识宣讲10/4/2022端粒酶对端粒3端的延长解决了末端复制109复和修复医学知识DNA的反转录合成Rev

49、erse transcription第三节110复和修复医学知识宣讲10/4/2022DNA的反转录合成第三节110复和修复医学知识宣讲10/2/RNA肿瘤病毒DNA原病毒（或前病毒） RNA肿瘤病毒Temin等提出，原病毒（provirus）DNA是RNA肿瘤病毒在复制过程中的中间物。*反转录的发现发展了中心法则111复和修复医学知识宣讲10/4/2022RNA肿瘤病毒Temin等提出，原病毒（provirus）DCrick：我本人的思想是基于两个基本原理，序列假说和中心法则。sequence hypothesis ： 核酸片段的特异性完全由其碱基序列所决定，而且这种序列是某一蛋白质氨基酸序

50、列的密码。central dogma ： 遗传信息只能从核酸传向蛋白质，而不能从蛋白质传向核酸。112复和修复医学知识宣讲10/4/2022Crick：112复和修复医学知识宣讲10/2/2022反转录病毒（retroviruses ）： RNA病毒，含有反转录酶反转录：在反转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。113复和修复医学知识宣讲10/4/2022反转录病毒（retroviruses ）： RNA病毒，含有RNA指导的DNA聚合酶活性；DNA指导的DNA聚合酶活性；RNase H的活性是指它能够从53和35两个方向水解DNA-RNA杂合分子中的RNA。一、反转录酶以tRNA为引

51、物合成双链cDNA反转录酶有3种酶的活性：114复和修复医学知识宣讲10/4/2022RNA指导的DNA聚合酶活性；一、反转录酶以tRNA为引物合反转录酶的结构115复和修复医学知识宣讲10/4/2022反转录酶的结构115复和修复医学知识宣讲10/2/2022反转录病毒的基因组结构116复和修复医学知识宣讲10/4/2022反转录病毒的基因组结构116复和修复医学知识宣讲10/2/2反转录病毒RNA基因组转变为双链cDNA的途径117复和修复医学知识宣讲10/4/2022反转录病毒RNA基因组转变为双链cDNA的途径117复和修复二、反转录病毒在宿主细胞内的主要活动（一）反转录合成双链cDN

52、A（二）双链cDNA插入宿主染色体形成原病毒原病毒或前病毒：存在于真核染色体中和反转录病毒RNA基因组相对应的双链DNA序列。118复和修复医学知识宣讲10/4/2022二、反转录病毒在宿主细胞内的主要活动（一）反转录合成双链cDgag基因编码几种病毒核心蛋白（衣壳蛋白）;pol基因编码3种酶：反转录酶、蛋白酶和整合酶;env基因编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白。（三）原病毒DNA转录产生病毒RNA具有自我复制能力的反转录病毒基因组含有3个基因：119复和修复医学知识宣讲10/4/2022gag基因编码几种病毒核心蛋白（衣壳蛋白）;（三）原病毒DN初级转录产物多蛋白Gag-Pol，经过蛋白酶

53、水解，可产生反转录酶、蛋白酶和整合酶。多蛋白Gag经过加工，生成4种病毒衣壳蛋白。env基因编码的Env蛋白，经过加工以后插入病毒外膜磷脂双层。这些病毒蛋白和病毒RNA基因组可以迅速组装成许多新的反转录病毒颗粒。（四）病毒RNA经翻译和包装形成反转录病毒颗粒120复和修复医学知识宣讲10/4/2022初级转录产物多蛋白Gag-Pol，经过蛋白酶水解，可产生反转反转录病毒的生活周期121复和修复医学知识宣讲10/4/2022反转录病毒的生活周期121复和修复医学知识宣讲10/2/20DNA损伤修复 DNA Damage and Repair第四节122复和修复医学知识宣讲10/4/2022DNA

54、损伤修复第四节122复和修复医学知识宣讲10/2/20DNA的可突变性与修复遗传物质保持代代持续依赖于把突变概率维持在低水平上：生殖细胞的高突变率将摧毁物种；体细胞的高突变率将摧毁个体。要使后代有很好的存活机会，DNA必须保持低的突变率。如果遗传物质具有绝对的忠实性，进化将失去动力，新物种（包括人类）不可能出现。生命和生物多样性依赖于突变和突变修复之间的良好平衡。123复和修复医学知识宣讲10/4/2022DNA的可突变性与修复遗传物质保持代代持续依赖于把突变概率维 一、多种因素可引起DNA损伤 碱基开环和糖苷键断裂引起碱基丢失 辐射或氧化损伤等引起碱基改变 化学因素可引起核苷酸插入或缺失 辐

55、射和化学损伤可引起DNA链断裂 物理和化学因素可引起DNA链间或链内交联 124复和修复医学知识宣讲10/4/2022 一、多种因素可引起DNA损伤 碱基开环和糖苷键断裂引起碱基胞嘧啶脱氨基鸟嘌呤脱落5-甲基胞嘧啶脱氨基鸟嘌呤损伤的形式125复和修复医学知识宣讲10/4/2022胞嘧啶脱氨基鸟嘌呤脱落5-甲基胞嘧啶脱氨基鸟嘌呤损伤的形式1UV导致嘧啶二聚体形成126复和修复医学知识宣讲10/4/2022UV导致嘧啶二聚体形成126复和修复医学知识宣讲10/2/2烯醇式结构的5-BrU与G配对吖啶类化合物可插入DNA双链导致双链结构改变127复和修复医学知识宣讲10/4/2022烯醇式结构的5-

56、BrU与G配对吖啶类化合物可插入DNA双链导128复和修复医学知识宣讲10/4/2022128复和修复医学知识宣讲10/2/2022几个概念：点突变、转换、颠换点突变：DNA序列上单个碱基的改变称为点突变，可分为转换与颠换两种。转换（transition）：同型碱基的取代称为转换，有4种形式。颠换（transversion）：异型碱基的取代称为颠换，有8种形式。129复和修复医学知识宣讲10/4/2022几个概念：点突变、转换、颠换129复和修复医学知识宣讲10/转换颠换点突变缺失插入130复和修复医学知识宣讲10/4/2022转换颠换点突变缺失插入130复和修复医学知识宣讲10/2/2倒位重

57、排131复和修复医学知识宣讲10/4/2022倒位重排131复和修复医学知识宣讲10/2/2022突变可能导致基因功能的改变如果突变发生在基因的蛋白编码区，则可能引起蛋白质结构改变如果突变发生在基因调控区，则可能引起蛋白质表达水平改变132复和修复医学知识宣讲10/4/2022突变可能导致基因功能的改变132复和修复医学知识宣讲10/2正常 mRNA正常 蛋白质同义突变错义突变无义突变框移突变当突变发生在蛋白质编码区133复和修复医学知识宣讲10/4/2022正常 mRNA同义突变错义突变无义突变框移突变当突变发生在蛋启动子突变：基因表达水平降低剪接位点突变：错误的剪接加尾信号突变：mRNA稳

58、定性下降当突变发生在转录调控序列134复和修复医学知识宣讲10/4/2022启动子突变：基因表达水平降低当突变发生在转录调控序列134复结构基因突变导致的蛋白质功能降低和丧失：镰刀型红细胞贫血是由基因突变导致的“分子病”。135复和修复医学知识宣讲10/4/2022结构基因突变导致的蛋白质功能降低和丧失：135复和修复医学知 结构基因突变导致的蛋白质功能增强癌基因Ras的突变导致其活性的异常增加 基因表达过高导致的蛋白质过量癌基因c-myc的基因扩增导致活性异常增加；病毒增强子的插入导致基因表达增强 基因突变导致蛋白质产生过少而功能缺失b-地中海贫血症的突变导致珠蛋白产生减少136复和修复医学

59、知识宣讲10/4/2022 结构基因突变导致的蛋白质功能增强136复和修复医学知识宣讲 二、DNA损伤修复系统有多种类型DNA聚合酶（Y-家族），如E.coli：UmuC嘧啶二聚体、无嘌呤位点跨损伤DNA合成E.coli：RecA和RecBCD双链断裂重组修复E.coli：UvrA, UvrB, UvrC, UvrD人：XPC, XPA, XPD, ERCCI-XPF, XPG嘧啶二聚体，碱基烷基化核苷酸切除修复DNA糖苷酶（即DNA糖基水解酶）碱基损伤碱基切除修复嘧啶二聚体直接修复E.coli：MutS, MutL, MutH人：MSH, MLH, PMS 复制差错错配修复酶损伤修复系统的类

60、型137复和修复医学知识宣讲10/4/2022 二、DNA损伤修复系统有多种类型DNA聚合酶（Y-家族），修复对象：将DNA中因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体分解。机制：细胞内光裂合酶（photolyases）分子中生色基团次甲四氢叶酸吸收光子并将FADH2激活生成的激发型FADH2，再将电子转移给嘧啶二聚体，使其还原。分布：分布广泛，除哺乳动物外均有之。（一）直接修复（direct repair）利用修复酶简单地逆转DNA损伤光复活修复系统138复和修复医学知识宣讲10/4/2022修复对象：将DNA中因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体分解。（一光复活修复系统139复和修复医学知识宣讲10/4/2