影响PCR扩增因素的分析

1、摘要 影响 扩增因素的分析PCR 的展以说是从 DNA 合成酵素的发现缘起 合酵素最早于 1955 年发现 (DNA polymerase 而较具有实验价值及可得性的 of E. 则是于 年的初期由 Dr. H. Klenow 所发, 但于这个酵素是一种易被热所破坏之 酵素 因不符合一连串的高温连锁反应所需。随着经济的全球化PCR 技术的广泛应用， 研究 PCR 技术的影响因素闲的愈来愈重要。关键 : 多聚酶链式反应 PCR 扩增技术 多重 PCR1PCR 术的原PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程， 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR 由变性 退火 延伸三

2、个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA 与引物的退火（复性）：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延伸： DNA 模 引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性 退火 延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又

3、可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2 分钟， 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction，PCR)，又称无细胞克隆技术(FreeBacteria Cloning 是一种根椐生物体内 DNA 制的某些特 点而设计的，在体外对特定 DNA 序进行快速扩增的技术。2PCR 术的发2.1 常规 PCR 测对细菌进行分类鉴定的常规 PCR 技术，主要是以高度保守的特定基因序列的基础上建立起来的，如核糖体 RNA(rDNA)、gyrB 基因、 因等。自 6O 年代末， 首次运用 rDNA 分析生物的系统发育以来， 数据库快速扩大已成为细菌多

4、样性系统进化与发育研究广泛采用的序列细菌的 16SrDNA 基因核苷酸序列具有高度保守性的序列变化与进化离相适应被称为一种进化分子钟由于其进化速度大约是每五千万年发生 1的碱基变化所以适用于种以上水平的鉴定究细菌 16SrDNA 最直接的方式就是通过基因测序并与 Genbank、EMBL、DDB 等国际用的数据库比对，根据同源性的大小确定细菌种的归类。 基因也是非常保守的序列，由于 它与 16SrDNA 基因是线性串 联排列 ，在此基础上 就发展 出利用16S-23SrDNA 基因间区序列来对细菌进行鉴定的方法基因区段的进化速度高于 16S rDNA ，因此可以发展成为细菌种甚至株的鉴定方法。

5、除此以外还有其它一些高度保守的序列 gyrB 因(细菌中广泛存在的一种编码DNA 的拓扑异构酶的 B 基的单拷贝基因)、toxR 基因弧菌中的毒素表达调控蛋白基因)等也越来越广泛的被用于对病原性细菌进行分子生物学鉴定。 2.2 多重 PCR 术多重 术是在常规 PCR 础上改进并发展起来的一种新型 PCR 扩增技术，其检测原理与传统 PCR 相同.果存在与各引物对特异性互补的模板，只不过是在同一反应体系中加入 1 对以上的特异性引物，那么就可以同时在同一个反应管中扩增出 l 条以上的目的 DNA 段。使用这一方法可以同时检测 1 个以上目的基因或者借助其交叉限制进行确认同时检测多种病原微生物。

6、该技术自 1988 年 Chamberlain 首次应用于杜氏营养不良症(Duchenne musculardystrophy)因外显子缺失的检测以来，已经在遗传 病诊断、转基因鉴定、病原体检测等各个领域成功的得到应用。23.影 PCR 技的因素究进展3.1 PCR 扩增影响因初探多聚酶链式反应(Polymerase chain reaction)简称PCR技术,是一种体外扩增特异DNA 片段的技术，此法操作简便,在短时间内获得数百万个特异性DNA序列的拷贝。影PCR 反应结果的因素较多，其中如何获得高质量的基因组DNA 模板以及PCR 反应体系中各种成分因子的优化组合，是获得清晰可重复的扩增

7、产物的前提，也是扩增反应能否成功的关键3为保证反应结果稳定性和可靠性，同时降低反应成本，必须系统地探讨基因组DNA 的CR反应体系中各种因素对扩增结果的影响，对PCR 进行优化，以期为目地基因CR 反应成功提供稳定可靠的方法。通过对实验条件进行摸索，确定最佳的CR 反应体系和反应条件，排除人为因素（如加样错误），据此反应体系和条件均能较好地扩增目标片段。实验结果发现PCR 反应混合物成分的比例和PCR 反应条件是PCR 反应成功的关键，为了保证高质量的CR 扩增产物应注意以下几点：DNA 模板的要求；引物与模板之间的比例，对CR 的特异性也是非常重要的 浓度过高可加快反应速度同时增加碱基的错误

8、掺入率即错配率和实验成本, 而低浓度的dNTP 会降低反应速度以及产物量可以提高实验 的精确度。PCR 反应的缓冲液。3.2理因素对发 NA PCR扩增结果的影响2+2+受高温、酸、碱、日晒、雨淋等环境因素的作 致使其人发DNA生质和量的变化, 影响DNA分析结果。用聚合酶链反应PCR)可对人体的一些组织, 如血痕、毛发及牙齿等进行性别鉴定4。实验研究了温度、湿度、pH、福尔马林、乙醇和土埋处理牙齿的PCR扩增,pH可影响NA的稳定性, 但pH在一定X围仍较稳定。pH过高或过低均可引起DNA 双链间氢键的破坏而变性,甚至也可引起链内共价键的破坏而发生DNA降解；福尔马林固定组织可以破坏NA分子

9、, 固定时间越长DNA 降解越多, 大部分DNA都降解成小片段,不适合RFLPs 分析。总之实验最后证实温度等均会影响PCR扩增环境条件是复杂多样的 对检材DNA的影响既可以是单因素作用, 也可能是多因素同时作用, 现仅报道部分理化单因素对人发DNA及其PCR性别鉴定结果的影响 其他问题尚待进一步 研究。3.3影多重CR扩增效的因素多重PCR要求不同引物能在同一反应体系中进行特异性扩增而影响其扩增效果的因素较多，主要有循环参数、反应体积、反应体系、引物间的碱基配对等。实验进行不同循环参数缓冲液及反应体积的对比，结果表明，循环参数中退火温度和时间、延伸时间及PCR缓冲液的成分影响多重PCR 的扩

10、增效果，而反应体积、循环次数对其扩增效果影响较小。在常规CR 中，一个反应体系一般采用一个退火温度。有些研究小组的多重CR 反应条件也采用一个退火温度也有一些研究小组在一个反应体系中采用多个退火温度PCR 缓冲液使用标准缓冲液由15mmol/LMg ，10mmol/L TrisHC1(PH8和50mmol/LKC1组成10。有文献报道T 、TritonX 100、明胶能增强PCR扩增的特异性10。因而，在多重CR缓冲液中常加入1mmol/L TMAC和2201TritonX 1O0。经多次对比实验，我们认为多PCR理想的缓冲液为： 15mmol/LMgC1 ，50mmol/L KC110mmo

11、l/L TrisHC1 pH一81mmol/LTMAC X 明胶重PCR(mutiplexPCR)技术因具有高效产率降低实验成本速实验进程等优点1988年Chambercian等首次提出这一概念起5、6，该技术已被广泛的应用于基因组结构与功能基因及数量性状基因座(quantitative traitlocus，QTL)定位等研究多重PCR要求不同引物能在同一反应体系中进行特异性扩增，因而影响其扩增效果的因素较多，主要有循环参数、反应体积、反应体系、引物间的碱基配对等。此外，如须用激光诱导荧光电泳技术，如BI373、ABI 3773700、CEQ 2000等系列D序列分析仪分辨多重PCR的扩增产

12、物，标记在引物5 端的荧光物质发生荧光衰变影响多重CR扩增产物的检测本实验以328对5 端标有HEX或TET或6一FAM 亚磷酸酰胺的引物及4O只cAU资源家系6F为材料进行循环参数PCR缓冲液及反应体积的多重PCR优化反应体系对比实验。实验结果表明循环参数、PCR缓冲液成分等影响多重PCR 的扩增， 而反应体积和循环次数对其扩增效果影响较小。参考献：1 世秀，X 新中，谢珍玉，周永灿。 PCR 技术在水产养殖动物细菌性病原检测中的应用. 现代渔业信息, 2006 年 7 月 第 2l 第 7 期 P11-132 玉霞黄鸣 食品检验中多重 PCR 术的应用. 中国卫生检验杂志 2008 年 5

13、 月第 18 卷第 期 P958-9603C.W.迪芬巴赫，G.S.德维克斯勒.PCR 技术实验指南M.：科学，4吴梅摘, 孙光云.分析扩增D N A 序列侧定人发的性别 . 法医学杂志, 1 9 9 1 ; 7 (l ) , 15 Chambercian J ，Gibbs R ，Ranier J of the duchenne m uscular dystrophy locus via m uti DNAamplification EJNucl Acids Res，1988(16)：1 141 l1566Mullis amplification ofDNA in ：the polym erase chain reaction Spring bor Syrup Quant 1986，51：267 Ponce M ，Robles ，Micol J throughput geneticmappingin Arabidopsos thalianaJMol Gen Genet，1999，261：4O8 4158 Rosenfield S I，Jaykus L AA multiplex reversetranscriptionpolyme