牛5种病毒性腹泻病诊断和防治技术规程

1、Q/LB.XXXXX-XXXX目次 TOC o 1-1 h t 标准文件_一级条标题,2,标准文件_附录一级条标题,2, HYPERLINK l _Toc84601730 前言 PAGEREF _Toc84601730 h II HYPERLINK l _Toc84601731 1 范围 PAGEREF _Toc84601731 h 1 HYPERLINK l _Toc84601732 2 规范性引用文件 PAGEREF _Toc84601732 h 1 HYPERLINK l _Toc84601733 3 术语和定义 PAGEREF _Toc84601733 h 1 HYPERLINK l

2、_Toc84601734 4 诊断 PAGEREF _Toc84601734 h 2 HYPERLINK l _Toc84601735 4.1 临床疑似病例判断依据 PAGEREF _Toc84601735 h 2 HYPERLINK l _Toc84601736 4.2 荧光定量RT-PCR鉴定腹泻相关病毒 PAGEREF _Toc84601736 h 2 HYPERLINK l _Toc84601737 5 防治措施 PAGEREF _Toc84601737 h 2 HYPERLINK l _Toc84601738 5.1 隔离 PAGEREF _Toc84601738 h 2 HYPER

3、LINK l _Toc84601739 5.2 消毒 PAGEREF _Toc84601739 h 2 HYPERLINK l _Toc84601740 5.3 对症治疗 PAGEREF _Toc84601740 h 2 HYPERLINK l _Toc84601741 5.4 特异性抗体治疗 PAGEREF _Toc84601741 h 2 HYPERLINK l _Toc84601742 5.5 疫苗紧急免疫 PAGEREF _Toc84601742 h 2 HYPERLINK l _Toc84601743 6 无害化处理 PAGEREF _Toc84601743 h 2 HYPERLIN

4、K l _Toc84601744 附录A（规范性） 牛5种腹泻病毒荧光PCR检测方法及结果判定 PAGEREF _Toc84601744 h 3 HYPERLINK l _Toc84601745 A.1 引物及探针 PAGEREF _Toc84601745 h 3 HYPERLINK l _Toc84601746 A.2 牛5种腹泻病毒荧光PCR检测方法及结果判定 PAGEREF _Toc84601746 h 3前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由四川省农业农村厅提出并归口。本文件由四川省市场监督管理局批准发布。本文件起

5、草单位：西南民族大学本文件主要起草人：汤承 张焕容 任玉鹏 向华 岳华 王远微 牛5种病毒性腹泻病诊断和防治技术规程范围本标准规定了牛病毒性腹泻黏膜病病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛纽布病毒和牛诺如病毒共5种病毒引起的牛病毒性腹泻病临床诊断和防治技术。本标准适用于上述5种腹泻相关病毒的检测,病毒性腹泻病诊断、疫情处理、预防与控制。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/ T 6682 分析实验室用水规格和实验方法GB/ T 1863

6、7-2018 牛病毒性腹泻粘膜病诊断技术规范GB/ T 19489 实验室生物安全通用要求NY/ T 541-2016兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 牛病毒性腹泻黏膜病 Bovine viral diarrhea-mucosal disease牛病毒性腹泻黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease, BVD/MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）感染引起的一种病毒性传染病。BVDV可引起牛呼吸道综合征、繁殖障碍性疾病、腹泻/黏膜病、免疫抑制和持续性

7、感染等。该病呈全球性流行，在养牛业发达国家危害尤为严重，造成全球乳/肉牛业严重的经济损失。在我国，BVD是进口动物检疫的二类传染病和跨省交易运输必检的疫病。BVDV是单股正链RNA病毒，基因组约为12kb13kb。整个基因组由三个部分组成，可分为5端非编码区（5untranslated region, 5UTR）、开放阅读框架区（open reading frame, ORF）和3端非编码区（3untranslated region, 3UTR）。3.2 牛轮状病毒病 Bovine Rotavirus disease牛轮状病毒病是由牛轮状病毒（Bovine Rotavirus，BRV）引起的以

8、呕吐、腹泻、脱水等为主要特征的人畜共患急性胃肠道传染病，尤其在幼龄动物中高发。该病已在全世界主要养牛国家和地区普遍发生和流行，给养牛业造成了严重的经济损失。BRV为呼肠孤病毒科轮状病毒属，无囊膜双链RNA病毒，分11个基因节段，分别编码6种结构蛋白（VPlVP4、VP6、VP7）和6种非结构蛋白（NSPlNSP6）。3.3 牛冠状病毒病 Bovine Coronavirus disease牛冠状病毒病是由牛冠状病毒（Bovine Coronavirus, BCoV）引起的新生犊牛腹泻、成年牛冬季腹泻和各年龄段牛呼吸道疾病。BCoV为不分段的单股正链RNA病毒，有囊膜。基因组全长大小介于3084

9、7 bp31100 bp，具有2个开放阅读框ORF1a和ORF1b，五种主要的结构蛋白：纤突蛋白（S）、血凝素/酯酶蛋白（HE）、核衣壳蛋白（N）、跨膜蛋白（M）和小膜蛋白（E）。3.4 牛纽布病毒病 Nebovirus disease牛纽布病毒病是由纽布病毒（Nebovirus, NeV）引起犊牛腹泻的疾病。NeV为单股正链RNA病毒，根据其重组酶聚合酶（RdRp）基因序列，NeV 可以分为 NB-like、NA1-like 和 DijonA216-like 3 种基因型；根据其完整VP1基因序列，NeV可以分为2个基因型（基因1型和基因2型），其中基因1型又细分为4个谱系（谱系14）。3.

10、5 牛诺如病毒病 Bovine norovirus disease牛诺如病毒病是由牛诺如病毒（Bovine norovirus, BNoV）引起的一种犊牛腹泻的疾病。NoV属于杯状病毒科，诺如病毒属，是单链的 RNA 病毒，基因组全长7.37.5kb。根据其基因特征，可将NoV分为6个基因型。诊断临床症状感染牛主要表现为体温升高，精神沉郁，食欲减退或废绝；多数病牛出现不同程度的腹泻，排出水样稀粪，内有气泡、粘液或血，气味恶臭；病牛甚至迅速脱水，死亡。荧光定量RT-PCR鉴定腹泻相关病毒4.2.1 样本采集与处理 采集肛门棉拭子 510 g，置RNA保存液，-20及以下保存运输不超过48 h,提

11、取并反转录合成 cDNA。4.2.2 样本检测 依据本标准附录A中提供的牛病毒性腹泻粘膜病病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛纽布病毒和牛诺如病毒荧光定量RT-PCR或iiPCR方法鉴定5种主要的牛腹泻相关病毒。防治措施隔离：发现疑似疫情，立即隔离患病动物。消毒：对病牛污染的场所、用具、物品彻底消毒。对症治疗：采取补液、强心、止泻和防止细菌继发感染等措施治疗患病动物。补液：复方氯化钠或生理盐水，重症者输注5%葡萄糖生理盐水或一定量的10%低分子右旋糖酐补液。强心：在补液同时选用毛花苷C、洋地黄毒苷、毒毛旋花苷K等强心剂强心。止泻：每头牛口服碱式硝酸铋1530 g形成一层薄膜保护肠壁止泻。防止细菌继

12、发感染：单一或联合使用喹诺酮类、氨基糖苷类、头孢类、磺胺类或酰胺醇类抗菌药物等12种防止细菌继发感染，采用肌肉注射或静脉注射。特异性抗体治疗：高免血清或卵黄抗体对发病牛紧急治疗，对受威胁牛紧急预防。疫苗紧急免疫：牛病毒性腹泻相关病毒疫苗紧急免疫预防。无害化处理患病牛及其产品按照“农业部关于印发病死及病害动物无害化处理技术规范”进行无害化处理。（规范性）牛5种腹泻病毒荧光PCR检测方法及结果判定引物及探针（10mol/L）NeV-F：5-CAGCCCGTCTGGGTGAAT-3；NeV-R：5-CTGGATRGTTCTGACTTCGG-3；BNoV-F：5-CCTYCACGGCGAGAAGTT-

13、3BNoV-R：5- CGGWGCGATGGTACAAARAT -3BCoV-F：5-AGTAGTGTCAGTGCTAAC-3BCoV-R：5-CAAGTGCCTGTAGGTATA-3BCoV-Probe：5-FAM-ACAACTTCCATCCCGCCAAA-TAMRA-3BVDV1-F：5-AAGCCTCGAGATGCCACG-3；BVDV1-R：5-GCAGCACCCTATCAGGCTGT-3；BVDV1-Probe：5-FAM-CCCACAGCACATCTTAA-MGB3BRV-F：GCTAACCACTTGGTATCCGBRV-R：GCCATCTGAGTGATTACTCTGBRV-Pro

14、be：FAM-TACGTATTCGCTACACAGAGTAATCA-BHQ1牛5种腹泻病毒荧光PCR检测方法及结果判定NeV 染料法 real-time PCR 检测反应体系及条件反应体系：TB Green Premix Ex Taq II 10 L，上、下游引物各 1.0 L，cDNA模板1.5 L，用DEPC H2O补齐到 20L。反应条件为：95 1 min；95 15 s、51 30 s，共40 个循环；熔解段 95 15s、60 1 min、95 ，15s，1个循环，反应结束。结果判定阈值设定检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管的荧光信号达到设定

15、的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪音情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。质控标准阴性对照无Ct值，且无典型扩增曲线；或阴性对照Ct值35.0，出现扩增曲线，但熔解曲线于88左右未出现明显的峰值，熔解曲线于84左右未出现明显的峰值。阳性对照Ct值35.0，出现扩增曲线，但熔解曲线于88左右未出现明显的峰值，表示样品中无病毒核酸，判定为阴性。Ct值35.0，出现典型的扩增曲线，熔解曲线于88左右出现明显的峰值，表示样品中存在病毒核酸，判定为阳性。30.0Ct值35.0，出现扩增曲线，但熔解曲线于88左右未出现明显的峰值，熔解曲线于84左右未出现明显的峰值。阳

16、性对照Ct值35.0，出现扩增曲线，但熔解曲线于88左右未出现明显的峰值，表示样品中无病毒核酸，判定为阴性。Ct值35.0，出现典型的扩增曲线，熔解曲线于88左右出现明显的峰值，表示样品中存在病毒核酸，判定为阳性。 30.0Ct值35.0，且出现扩增曲线的样本判定为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为阳性，否则判为阴性。BCoV 探针法 real-time PCR 检测反应体系及条件PCR反应体系：Probe qPCR Premix Ex Taq 10 L，探针0.4 L（10 mol/L），上下游引物各0.8 L（10 mol/L），cDNA模板2 L，DE

17、PC H2O补足到20 L。反应程序为：95 2 min；95 15 s，54 20 s（采集荧光），40个循环。结果判定阈值设定阈值设定原则根据仪器噪音情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准。质量控制阴性对照：FAM通道无报告Ct值或无典型的S型扩增曲线，TAMRA通道无报告Ct值或无典型的S型扩增曲线。阳性对照：FAM通道CT值35，TAMRA35，且2个通道扩增曲线均为典型的S型。上述阴性对照和阳性对照结果要求在同一次实验中同时满足，否则，本次试验无效，需重新进行。结果描述及判定被检样本检测结果中 FAM 通道Ct值36，TAMRA 通道36，且扩增曲线均为典型的S曲

18、线，报告为BCoV核酸阳性；36Ct值40，判定为可疑，可疑样品应重新检测，如重复后仍为36Ct值40，且扩增曲线均为典型的S曲线，报告为BCoV核酸阳性。被检样本检测结果中 FAM 和 TAMRA 通道均无CT值或无典型的S型扩增曲线，报告为 BCoV 核酸阴性。BVDV 1型 iiPCR 检测反应体系及条件反应体系：Taq酶 1L，预混Buffer 25L，引物上下游各 3.5L（10molL-1），探针 0.3L（10molL-1），反转录酶1.5L（20UL-1），cDNA模板2L，DEPC H2O 13.2L，共 50L。反应条件：42，30 min，93，15 sec，60,1 m

19、in，40个循环。反应信号由iiPCR仪光学探测模块自动识别，其反应结果通过系统默认的S/N值进行计算并被转化为 “+” (positive)，“” (negative) 和 “？” (inconclusive) 显示在屏幕上。结果判定质量控制阴性对照：经 iiPCR 反应，结果显示为“-”。阳性对照：经 iiPCR 反应，结果显示为“+”。上述阴性对照和阳性对照结果要求在同一次实验中同时满足，否则，本次试验无效，需重新进行。结果判定被检样本检测结果中，iiPCR仪显示为“+”者判定为阳性；iiPCR仪显示为“-”判定为阴性。BRV iiPCR 检测反应体系及条件反应体系：Taq酶 1L，预混

20、Buffer 25L，引物上下游各 3.5L (10molL-1)、探针0.25 L (10molL-1)、反转录酶 1.25L (20UL-1)、cDNA模板 2L、DEPC H2O 13.5L，共 50L。反应条件：42，30 min，93，15 sec，60,1 min，40个循环。结果判定质量控制阴性对照：经 iiPCR 反应，结果显示为“-”。阳性对照：经 iiPCR 反应，结果显示为“+”。上述阴性对照和阳性对照结果要求在同一次实验中同时满足，否则，本次试验无效，需重新进行。结果判定被检样本检测结果中，iiPCR仪显示为“+”者判定为阳性；iiPCR仪显示为“-”判定为阴性。参考文

21、献农业部关于印发病死及病害动物无害化处理技术规范。牛5种病毒性腹泻病诊断和防治技术规程标准编制说明一、编制目的及任务来源牛病毒性腹泻是养牛业中最常见的疾病，一年四季皆可发病，各养牛业发达国家均有流行，给我国的养牛业造成了巨大的经济损失。牛病毒性腹泻由多种病毒引起，主要有牛病毒性腹泻黏膜病病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛纽布病毒和牛诺如病毒5种病毒。这5种病毒感染过程中具有发热、腹泻及脱水等相似的症状，治疗不及时易导致犊牛死亡，也会严重影响牛犊的正常生长发育。精准诊断、疫苗免疫、抗菌和补液是防治牛病毒性腹泻的主要手段。几种牛病引起的腹泻病的诊断和防治技术具有相似之处，如临床症状、疫苗免疫、特异性

22、抗体治疗、抗菌和补液治疗。目前，国内外已有针对牛病毒性腹泻的临床诊断、实验室诊断、预防和治疗等技术。但需要标准化、规范化，以指导该技术在生产中的应用。因此，在参考国内外最新研究进展的基础上，结合本标准起草单位的研究成果，申报起草牛5种病毒性腹泻病诊断和防治技术规程。该标准规定了牛5种腹泻相关病毒感染引起的腹泻病的临床疑似病例的判断，样本采集与处理，荧光RT-PCR检测，疫苗预防，抗菌和特异性抗体治疗和补液对症治疗等规范。填补国内相关标准的空白。为了促进我国养牛业的健康发展，结合“十三五”农村领域国家科技支撑计划课题牛羊主要疫病综合防控技术集成、创新与应用 (2016YFD0500907)，标准

23、起草单位提出制订牛5种病毒性腹泻病诊断和防治技术规程。二、编制过程本标准下达后，西南民族大学成立了牛5种病毒性腹泻病诊断和防治技术规程标准编制小组。结合“十三五”农村领域国家科技支撑计划课题牛羊主要疫病综合防控技术集成、创新与应用 (2016YFD0500907)的实施，组织专家多次深入四川、青海和西藏等青藏高原牧区开展关于牛病毒性腹泻黏膜病、牛冠状病毒病、牛轮状病毒病、牛纽布病毒病和牛诺如病毒病等5种牛病毒引起的腹泻病的诊断和防治工作。同时，在实验室对5种牛病毒性腹泻病毒的病原学特性及分子生物学特性等展开研究，对5种牛病毒性腹泻病诊断和防治技术规范所涉及的临床症状判断标准，样本的采集与处理规范，荧光RT-PCR检测，疫苗预防，抗菌和特异性抗体治疗和补液对症治疗等进行验证和优化。最终根据实验研究成果，并广泛征求省内外相关专家的意见，形成了本标准（征求意见稿），并广泛征求专家意见后，根据专家意见，在征求意见稿的基