实验五 转化及重组子的筛选课件

1、 实验五 转化及重组子的筛选一、实验目的 了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义；学习外源DNA转化入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 二、实验原理 转化（transformation）是将异源DNA分子导入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。其原理是细菌处于0， CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞表现新的遗传性状。将经转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体(transfo

2、rmant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。基因导入方法:1)电击法 (Gene transfer by electroporation)基因导入方法:2)基因枪法(Biolistic-bombardment)(植物细胞)Transfer of T-DNA from Agrobacterium into a plant cell Regeneration of leaf disks infected by AgrobacteriumDNA重组外源基因插入与否可通过载体上的Lac Z基因进行初步的筛选。有外源基因插入的细菌呈白斑，无外源基因插入的细菌呈蓝斑。Alfa互补蓝-白颜色筛选(互补)一

3、种巧妙的鉴定重组质粒的方法：是蓝-白颜色筛选。该法可以在同一转化平板上完成筛选。这种方法涉及基因的插入失活：它利用一种蓝色化合物的形成作为指示剂。在这种情况下失活基因是lacZ，该基因编码-半乳糖苷酶，受lac启动子的调控。lacZ中间又插入了一段人工设计的DNA序列，称为多克隆位点（MCS），含多个常用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的片段能很方便的被插入在此，当外来序列插入后则破坏了lacZ编码的半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈白色。即重组质粒中lacZ的插入失活将导致不能形成蓝色菌落。该方法具体操作是将转化细胞涂布于含氨苄青霉素、IPTG和X-gal的平板上，形成有蓝白两色的菌落混合群体。

4、X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷，一种生色底物； IPTG：异丙基-D-硫代半乳糖苷，一种诱导物白色菌落未表达-半乳糖苷酶，因而可能含有插入的目的片段，而蓝色菌落很可能是自环载体的克隆。当E.coli菌株表达 Lac阻抑物，则载体上的lacZ基因由IPTG 诱导表达，表达形成的酶可以利用底物 X-gal形成一种蓝色化合物。实际上这种方法中所用到的载体都是有一个lacZ截短后的衍生物是lacZ，此基因编码-半乳糖苷酶的N端的肽。这种载体须转入一种含有表达-半乳糖苷酶的C端部分的突变基因的宿主菌，使表达的-半乳糖苷酶的C端能与肽互补产生有活性的酶。这样做的好处是缩短了质粒所载基因

5、的长度，但又没有改变该法的原理。如pUC18携带细菌lacZ基因片段，可以编码-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的肽段。这种互补的原理也被用于某些噬菌体载体上，如gt11。三、实验仪器、材料与试剂 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 恒温水浴锅 4. 恒温箱 5. 微量取液器 6. 培养皿材料 1. 实验四所得的连接产物 2. 实验五制备的大肠杆菌感受态细胞 试剂 LB固体培养基 ：每升LB培养基中加15g 琼脂。氨苄青霉素（Amp）：用无菌水配制成 50mg/mL溶液，0.22m滤膜过滤除菌 后，置-20冰箱保存。(300mg 6mL ddH2O溶解， 0.22m滤膜过滤除菌)X-ga

6、l (20mg/mL): 80 mg 4mL 二甲基甲酰胺溶解，分装，避光保存。ITPG (200mg/mL): 300mg 1.5mL ddH2O溶解， 0.22m滤膜过滤除菌。四、实验步骤 取5-10L连接产物加到200L分装的感受态细胞中。轻轻混匀，冰浴30min； 42（水浴中）热激90s，迅速在冰浴中冷3- 5min； 在上述管中加入600L LB培养基，于37振荡（慢摇）培养45min-1hr； 制LB平板：将LB固体培养基溶化为液体，冷却到50-60时，在150 mL培养基中加氨苄青霉素（50mg/mL）150L，使终浓度为50g/mL。 pMD18-T Vector 混匀后倒入

7、7-8个平皿中，待其凝固后，于LB平板中央加入X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷，为生色底物）40L和IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）10-20L。用灭菌的涂棒将X-gal和IPTG均匀涂布于平板上。吸取300-500L菌液（或将菌液离心后仅留少量的上清悬浮，取部分浓缩液），涂布于LB平板（含Amp+，X-gal和IPTG）上。室温涂布均匀后（至菌液完全被吸干），于37倒置，过夜（12-16hr）培养； 观察菌落，筛选阳性克隆。 五、注意事项将连接产物加到感受态细胞后，混匀动作要轻。加氨苄青霉素到培养基中，溶化的培养基温度应在50-60，不能过高。保证无菌操作，防止污染。载体结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位载体