猪流感病毒检测套式反转录聚合酶链反应法

1、猪流感病毒检测套式反转录聚合酶链反响法范围本标准规定了基于RT-nestedPCR方法检测猪流感病毒的实验室 生物安全要求、试剂和材料、仪器、操作程序及结果判定。本标准适用于猪流感病毒的检测。术语和定义以下术语和定义适用于本文件。猪流感病毒swine i nfIuenza v i rus , SIVSIV属于正粘病毒科，甲型流感病毒属。基因组为线状单股负链 RNA,约13. 6 kb,由大小不等的8个独立节段组成。在病毒的编码 基因中，NP基因较为保守，可作为不同亚型流感病毒分子诊断的靶 基因。聚合酶链式反响 po I ymerase cha i n react i on , PGRPCR技术

2、是一种在体外快速扩增特定DNA片段的方法。由热变性 一复性一延伸三步反响组成一个PCR循环，经过屡次循环反响，使目 的DNA得以大量扩增。定为SIV阳性，记为（+ ）；假设在该位置未出现一条特异性DNA条带，那么判定为SIV阴性,记为（一）。检测结果凝胶电泳图见附录A. 2O（规范性附录）特异性引物序列及检测结果凝胶电泳图示特异性引物序列合成的特异性引物序列应符合表A. 1的要求。特异性引物序列，引物种类b引物 名称。特异性引物的核甘酸序列SIV外套。SIVP1，5 - ATG GAC GAA GAA CAA GGA TTG C - 33 SIVP2 5 - TCT CAG TTC AAG A

3、GT GCT GGA G - 3，SIV内套SIVP3- 5- GCC CAT TTG TCC TGC TTG CCT GC - 3，1 SIVP45 - AGC AAT CTG AAC TCC TCT AGT G - 3，套式PCR检测结果凝胶电泳图示套式PCR检测结果凝胶电泳图如图A. 1所示。2000bplOOObp500bp250bp lOObp12345678标准 DNA 分子量(DL 2000 bp ladder DNA marker)；2-6临床样品（+ ）;7阳性对照（+ ）；8阴性对照（一）；“十”表示检测结果为阳性；“一”表示检测结果为阴性。SIV套式PCR检测结果琼脂糖凝

4、胶电泳图(规范性附录)试剂的配制mo I /L PBS (pH 7.2)的配制mol/L PBS (pH 7.2)按以下方法进行配制：氯化钠:8. 0 g；氯化钾：0.2 g；磷酸氢二钠:1.44 g；磷酸二氢钾：0. 24 g；双蒸水：定容至1 000 mL；在800 mL双蒸水中依次加入其余成分，用1 moL/L盐酸调节溶 液的pH至7. 2,加水定容至1 000 mL,l. 034X105Pa高压灭菌25 min。 室温保存。75%乙醇的配制75%乙醇按以下方法进行配制：无水乙醇：750 mL；灭菌双蒸水：250 mL；在750 mL无水乙醇中加入250 mL灭菌双蒸水，4 保存。0.

5、1%DEPC水的制备0. 1% DEPC水按以下方法进行配制：焦碳酸二乙酯(DEPC) ： 0. 1 mL；双蒸水：100 mL；将0.1mL DEPC加入100 mL双蒸水中配成0. 1%的水溶液，室温 作用12h以上，其间间歇摇匀几次或在室温下磁力搅拌20 min,然 后1.034X 1()5 高压灭菌30 nli口。室温保存。DEPC是强的蛋白变性剂和致癌物。开瓶时应使瓶子尽可能远离自 己，因内部的压力可能导致飞溅。0.5mol/L EDTA (pH 8. 0)的配制0. 5 mol/L EDTA (pH 8. 0)按以下方法进行配制：二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2 - 2H20

6、) ： 186. 1 g；氢氧化钠：20. 0 g；双蒸水：定容至1 000 mL；在800 mL双蒸水中加入186. 1 g EDTA-Na2 - 2H20,在磁力搅拌 器上剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液pH值至8.0 (约需20. 0 g氢氧 化钠颗粒)，然后定容至1000mL,分装后1.034X 105 pa高压灭菌30 min。室温保存。10% SDS的配制10% SDS按以下方法进行配制：十二烷基硫酸钠(SDS) ： 100.0 g；双蒸水：定容至1 000 mL；在900 mL双蒸水中溶解100.0 g电泳级SDS,加热至68 助溶, 用浓盐酸调节溶液的pH值至7. 2,加水定容至1

7、 000 mL,分装备用。 室温保存。10 mg/mL漠化乙锭的配制10 mg/mL澳化乙锭按以下方法进行配制：漠化乙锭(EB) ： 1.0 g；双蒸水：100 mL；在100 mL双蒸水中加入1.0 g漠化乙锭，用铝箔包裹容器,磁力 搅拌数小时以确保其完全溶解，然后移至棕色瓶中，保存于室温。澳化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液 时应戴上手套，称量染料时应戴面罩。凝胶加样缓冲液的配制凝胶加样缓冲液按以下方法进行配制：蔗糖：40. 0 g；0. 5 mol/L EDTA (pH 8. 0) ： 20 mL；10% SDS： 5 mL；漠酚蓝：50. 0 mg；双蒸水：75 m

8、L；先将蔗糖完全溶解于双蒸水，然后按顺序加入其余各成份，待所有 成分溶解混合均匀后，用0. 22 um的微孔滤膜过滤除菌，4 c保存。Tr i s-硼酸电泳缓冲液的配制5倍Tr i s-硼酸电泳缓冲液的配制Tris： 54. 0 g；硼酸：27. 5 g；0.5mol/L EDTA (pH 8.0) ： 20 mL；双蒸水：定容至1 000 mL。1倍Tr i s-硼酸电泳缓冲液的配制1倍丁刀5-硼酸电泳缓冲液按以下方法进行配制: 5倍Tris-硼酸电泳缓冲液：io0 mJ双蒸水：400 mLo所用试剂均为分析纯(AR)产品。（规范性附录）漠化乙锭溶液的净化处理浓度高于0. 5 mg/mL的漠

9、化乙锭溶液的净化处理将澳化乙锭溶液用水稀释至浓度低于0. 5 mg/mL,加入1倍体积 的0. 5mol/L KMnO4,混匀，再加入等量的25 mol/L HC1,混匀,置 室温数小时，最后加入1倍体积的2. 5 mol/L NaOH,混匀并废弃。浓度低于0. 5 mg/mL漠化乙锭溶液的净化处理按1 mg/mL的量加入活性炭，室温放置lh,不时轻摇混匀，用 滤纸过滤后丢弃，并将活性碳与滤纸密封后丢弃。废弃浸化乙锭接触物的净化处理回收至黑色的玻璃瓶中，定期进行无害化处理。套式 PCR nested PCR套式PCR是一种通过两轮PCR反响，使用两套引物扩增特异性DNA片段的方法。第二对引物特

10、异性的扩增位于首轮PCR产物内的一 段DNA片断，从而提高反响的特异性和敏感性。引物pr imer与待扩增DNA片段两端互补的一段寡核甘酸。特异性引物 spec i f i c pr i mer针对特定模板DNA片段设计的一段互补寡核甘酸，在PCR反响中 与模板DNA特异性结合。实验室生物安全要求试验操作应在生物安全n级（BSL-2级）以上实验室进行。试剂和材料特异性引物根据SIV NP基因的核甘酸序列设计两对引物，分别为一对外套 引物和一对内套弓I物，扩增DNA片段大小为287bp，引物使用浓度为50 mmol/Lo引物序列见附录A. 1。使用前先用灭菌双蒸水稀释。引物稀 释后分装成小剂量置

11、于-20 保存备用。RNA提取试剂RNA提取试剂如下：Trizol；氯仿；异丙醇；75%乙醇；0. KDEPC 水。反转录试剂反转录试剂如下：M-MuLV反转录酶；dNTPs 混合物:包括 dATP、dTTP、dCTP、dGTP；RNA酶抑制剂。PCR试剂PCR试剂如下:Taq DNA聚合酶；dNTPs 混合物:包括 dATP、dTTP、dCTP、dGTP；MgCl2o 电泳试剂电泳试剂如下：10 mg/mL漠化乙锭；10倍凝胶加样缓冲液；1倍Tris-硼酸电泳缓冲液。其它试剂其它试剂如下：无水乙醇；灭菌双蒸水；灭菌1 mol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS） , pH 7.2O试剂配制方法试剂配制

12、方法见附录B。一次性耗材本方法使用以下一次性耗材：PE一次性手套；离心管：1. 5 mL；PCR 反响管：0.2 mL；吸头：1 000双、200叱、10叱等多种规格。仪器本方法使用以下仪器:PCR 仪；电泳仪；电泳槽；紫外光透射仪；凝胶成像系统；低温离心机；小型高速离心机；水浴锅；旋涡振荡器；乳钵或玻璃研磨器；微量加样器:100此1 000比、2O|1L200于L、10L100心0. 5 pL-10 pL和0. 1迎2. 5陷等多种规格。操作程序待检样品处理 肺脏组织样品的处理无菌采取待检猪的肺脏组织0. 5 g1. 0 g ,置灭菌乳钵中剪碎，充分研磨，用灭菌1 mol/L PBS溶液配成

13、1 ： 5乳悬液,反复冻融3次。 8 000 r/min离心5 min ,收集上清液，供RNA提取或置-20 保存 备用。鼻拭子和气管拭子样品的处理无菌采取待检猪的鼻拭子和气管拭子，置于1 mL lmol/L PBS溶 液中，经旋涡振荡，收集上清液，供RNA提取或置-20保存备用。待检样品RNA提取取上述处理好的样品300叱于1. 5位无RNA酶离心管中，每管 加入500叱Trizol试剂，混匀，室温放置lOmin；加入160叱氯仿， 混匀，室温放置3min, 4 12000r/min离心10 min。取上清400叱 于一个新的无RNA酶离心管，加入500叱异丙醇，混匀，室温放置10 min,

14、 4 12 000 r/min离心10 min。弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤 一次，在超净台中通风晾干，加入30HL0. K DEPC水溶解沉淀，并 于55 -60 孵育lOmin,获得的RNA样品可直接进行反转录或置 -70 保存备用。RT-nested PCR 检测RNA样品反转录(RT)在冰浴条件下，按以下试剂用量在PCR反响管中分别加入各成分: 5 XBuffer： 5. 0叱，终浓度为1倍；200 U/叱M-MuLV反转录酶：0.5比，终浓度为4U/叱；40 U/叱RNA酶抑制剂：0.5乩，终浓度为0. 8U/叱；10 mmol / L dNTPs 混合物：2 叱，终浓度为 0. 8

15、 mmol / L；50 nlmol/L SIV夕卜套下游弓|物(SIVP2) ： 1比，终浓度为2 mmol /Lo待检样品RNA： 16叱；总体积为25双。加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反响管置于 PCR仪内，按如下程序进行反转录反响：42 lh；然后95 5mino 反转录获得的cDNA可直接进行PCR反响或置-20保存备用。nested PCR 检测第一轮PCR在冰浴条件下，按以下试剂用量在PCR反响管中分别加入各成分：10XBuffer： 2. 5叱，终浓度为1倍；25 mmol/L MgCl2： 1. 5 叱，终浓度为 1. 5 mmol/L；1 U/叱Taq DNA聚合酶：0.

16、 5叱，终浓度为0. 02 U/叱；50 mmol/LSIV外套上、下游引物(SIVP1和SIVP2)：各0.5叱，终浓度为1 mmol/L；10 mmol/L dNTPs 混合物：0. 5 叱，终浓度为 0. 2 mmol/L；待检样品cDNA： 2叱；灭菌双蒸水：17叱。加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反响管置于PCR仪内，按如下 程序进行PCR反响：95 5 min；然后进入95 30 s , 64 30 s, 72 1 min的循环，共进行30个循环；72 10 min ； 4 结束扩增。第二轮PCR在冰浴条件下，按以下试剂用量在PCR反响管中分别加入各成分：10XBuffer： 2.

17、 5叱，终浓度为1倍；25 mmol/L MgCl2： 1. 5 ML,终浓度为 1. 5 mmol/L；1U/叱Taq DNA聚合酶：0. 5叱，终浓度为0. 02 U/叱；50 mmol/L SIV内套上、下游引物(SIVP3和SIVP4)：各0.5叱，终浓度为1 mmol/L；10 mmol/L dNTPs 混合物：0. 5 叱，终浓度为 0. 2 mmol/L；第一轮PCR产物：2叱；灭菌双蒸水：17叱。加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反响管置于PCR仪内，按如下 程序进行PCR反响：95 5 min；然后进入95 30s , 58 30s, 72 30s的循环，共进行30个循环；72

18、 lOmin ； 4 结束扩增。PCR产 物可直接进行琼脂糖凝胶电泳分析或置4 C保存备用。阳性及阴性对照阳性对照用SIV标准参考株作为阳性对照，RNA提取程序按照6.2, RT-nested PCR检测程序按照6. 3。阴性对照用灭菌双蒸水作为阴性对照，nested PCR检测程序按照6. 3. 2。电泳1%琼脂糖凝胶的制备及放置将凝胶托架水平放置在工作台上，并放上梳子。称取1.0g琼脂 糖，加入100矶1倍Tris-硼酸电泳缓冲液，加热溶解琼脂糖，待琼脂糖溶液冷却至50 时，加入10 mg/mL澳化乙锭溶液5叱，使其终 浓度为0.5 ug/niL,充分混合，防止起气泡，倒入凝胶托架，凝胶厚 度控制在3 mm5 mm之间，待凝胶完全凝固后轻轻拔出梳子。将凝 胶连同托架一起放入电泳槽中，加入1倍Tris-硼酸电泳缓冲液，使 之浸过