生物技术制药2013课件

1、 生物技术制药学 梁 涌 涛3 第一章 绪 论第一节 简介一、前言 1、自我介绍： 2、课程要求： 3、参考书： 4、学时分配：二、专业介绍 1、吉林大学： 2、专业去向： 3、生物技术药物行业状况(学术外)：第二节 概论一、药 1、药物 2、药品 3、生物制品二、生物技术 1、生物技术 2、生物技术发展的三阶段 1 传统阶段 2 近代阶段 3 现代阶段3、生物技术在医药工业中的应用及成果4、基因工程制药工业迅速发展的原因5、生物技术的新进展 1 基础研究深入 2 新产品出现 3 新试剂 4 新生物反应器 5 改造传统工业三、生物药物 1、生物药物 2、分类 3、按用途分类四、生物技术药物 1

2、、生物技术药物 2、分类 3、主要品种类型 第二章 生物制药（生物药物） 第一节 生物药物概述 生物技术制药： 上游技术：生物技术 下游技术：分离纯化技术(生物制药) 关于生物药物 药品： 化学药 中药、天然药物 生物制品（生物药物 抗 生素除外） 二、生物药物的性质与分类1、性质药理学性质：治疗针对性强 活性高 毒副作用小、营养价值 高 生理副作用常有发生 具有更高的生化机制 合理性 受体效应 多效性和网络性效应生产制备的性质：材料中有效成分低 稳定性差 易腐败 注射 用药有特殊要求 储存有特殊要求检验特殊性：活性 同源性 一致性 安全性 2、分类按化学本质和化学特性：氨基酸 蛋白质和多肽

3、酶与辅酶 核酸及其 降解物和衍生物 多糖 脂类 细胞生长因子 生物制品按材料来源：人体组织 动物组织 植物组织 微生物 海洋生 物 按生理功能和用途：治疗 预防 诊断 其它生物医药用品 三、生物药物的研究发展趋势表现为：1、资源综合利用与扩大开发 脏器 血液 人尿 扩大开发资源 2、发现新生理活性物质，重新认识评价原有药物 3、药物新剂型日益增多 4、生物技术应用于制药行业组织细胞破碎： 物理法 化学法 生物法细胞器分离： 破碎细胞后离心二、生物活性物质提取 提取： 1、物质性质与提取 物质性质与提取方法的选择 可供选择的性质：溶解性 分子量 等电点 稳定性 比重 粒度 粘度等 提取原则： 在

4、保持活性的前提下目的物最大溶出，杂质最小溶出。 注意事项： 酶类：防止辅酶丢失、失活因素干扰 蛋白质类：高级结构破坏的变性作用 多肽、核酸类：防止酶降解，添加酶抑制剂 脂类：防止氧化，添加抗氧剂活性物质的保护措施： 缓冲系统 pH缓冲系统 添加保护剂 还原剂 金属螯合剂 抑制水解酶 加EDTA 加热 酶抑制剂 其它保护措施 避光、高温、氧化、激烈搅拌3、提取方法酸、碱、盐水溶液提取： 可提供离子强度、pH、缓冲能力表面活性剂提取： 阴离子型 阳离子型 中性 非离子型有机溶剂提取： 溶剂：甲醇 乙醇 丙酮 丁醇 乙醚 氯仿 苯等 好处：抑菌、抑制酶活性、沉淀杂蛋白考虑溶剂去除三、生物活性物质的浓

5、缩与干燥1、浓缩： 盐析 有机溶剂沉淀 葡聚糖凝胶 聚乙二醇反透析 超滤真空减压 薄膜2、干燥： 减压 喷雾 冷冻干燥：包括预冻结 升华 再干燥 优点：四、生物活性物质分离纯化的基本原理和方法1、根据分子形状和大小不同；2、根据分子电离性质不同；3、根据分子极性大小及溶解度不同；4、根据吸附性质不同；5、根据特异性。分离纯化设计：未知结构组分 1、确定研究目的和分析鉴定方法 2、研究理化性质及稳定性预备试验 3、确定材料处理及抽提方法 4、分离纯化方法摸索 5、产品均一性测定选择分离纯化方法时要考虑几个问题 1、提取时目的物最大,杂质最小溶出 2、分离方法分辨率由低至高3、纯化方法使用程序 各

6、种方法交叉使用4、分离后要采取保护措施 分离方法评价 分辨能力 重现性 回收率（5-6步25%以上） 均一性鉴定: 方法：电泳 色谱 化学组成分析五、中试放大设计中试放大： 需具备的条件：1、收率稳定，质量可靠2、操作条件确定，产品、中间体及原料分析方法已经确定3、生物材料资源已确定4、环境保护问题已经解决5、中试规模、材料规格、数量已经确定6、提出安全生产要求研究内容： 确定工艺路线与各步反应方法 设备材质与型号 反应器规模及搅拌器类型 生产反应条件 工艺流程与操作方法 安全生产与环保 原辅材料中间体理化性质、化学常数及质量标准 成本核算 第三节 生物药剂剂型的发展一、缓释型生物泵储存相渗透

7、压诱发物质半透膜第四节 灭菌一、干热空气灭菌160-170 1小时或140 3小时 芽孢杆菌二、湿热灭菌1、常压 100 30-60min 不能杀芽孢2、热压灭菌 超过一个大气压 可杀芽孢115.5 1.7kg/ 平方厘米 30min121.5 2.0kg/平方厘米 20min126.5 2.4kg/平方厘米 15min3、低温间歇灭菌 80 灭菌1小时 20-25 放24小时 再80 加热1小时 如此3次三、紫外线灭菌 1.5m以内 6-15立方米一个紫外灯四、过滤除菌 膜孔径0.2m五、化学灭菌 甲醛 安全性 1、毒性试验 2、防腐剂 3、热原质 4、安全试验 效力 1、浓度 （含菌数、抗

8、原量测定）2、活菌率 或病毒含量 3、免疫抗体含量 4、稳定性试验 热原质： 人工免疫： 自动免疫： 被动免疫： 第三章 基因工程制药 第一节 概述现代生物技术： 基因工程 细胞工程 发酵工程 酶工程 抗体工程等基因工程制药(含义)：一、基因工程制药发展概况1、基因工程制药发展简史2、基因工程制药发展现状 自1976年世界第一个DNA重组技术公司在美国成立，从1982年第一个人胰岛素上市，现有400多生物技术药物进入市场或临床试验。 发展比较快的有：美、英、德、日、法，法国肥胖研究领先，印度糖尿病研究领先。生物技术制药产业与其它产业相比发展速度飞快，目前以25%的速度增长。 上市的品种有： 年

9、销售额10亿美元以上的有：EPO（47）、人生长激素（30）、集落刺激生长因子（12）、人胰岛素（15）、干扰素（14） 研制阶段的有：3、我国基因工程药物的状 起步晚但发展比较快，从销售额来看：98年7亿、99年12亿、00年22亿、05年50多亿。 上市的药物有20多种，其中1b干扰素、链激酶、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子为一类新药。世界范围销售额前十位的基因工程药品我国已经能生产8种。现在有40多种处于研究阶段。我国生产的主要品种：人干扰素（1b、2a、2b、）白介素2、链激酶、胰岛素、人生长素、乙肝疫苗、痢疾疫苗、表皮生长因子（内、外用）、碱性成纤维细胞生长因子（外用）、EPO

10、、粒细胞、巨噬细胞粒细胞集落刺激生长因子二、传统生物制药存在的问题： 1、无法大批量生产 2、造价高 3、供不应求 4、抗原性 5、受病毒污染 三、基因工程制药的特点： 1、大量生产药用生理活性蛋白和多肽供临床使用 2、提供多的生理活性物质用于研究，扩大其应用范围 3、发掘更多的内源性生理活性物质 4、改造作为药物的内源性生理活性物质存在的不足 5、获得新型化合物，扩大药物筛选来源 基因工程技术产品预防用的各种疫苗、治疗用药物、诊断试剂主要是蛋白质和多肽，以及核酸类药物，有： 1、免疫性蛋白：抗原、单抗。5、反义、基因治疗药物 2、细胞因子： 3、激素： 4、酶类：未来十几年生物制药发展的主要

11、领域： 肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、器官移植、心血管、基因病等 原核细胞 真核细胞 DNA分离纯化 载体DNA 染色体DNA 限切酶 第二节 基因工程药物生产的基本过程基因工程技术： （含义）基本过程： 退火、连接 转化 培养 重组转化体基因工程药物生产的一般程序：获得目的基因、克隆获得目的基因、克隆组建重组质粒构建工程菌或细胞培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装 第三节 目的基因的获得一、直接分离法：（特殊基因） 非洲爪蛙rDNA和5sDNA基因，dA+dT含量与其它基因有显著差异且较多重复序列，汞离子能与dA、dT特异性结合，可增大其密度，用离心法分离。 真核基因不能

12、用以上方法，因为：二、反转录法： 过程：先分离纯化目的基因的mRNA 反转录酶 DNA DNA聚合酶 反转录酶 DNA聚合酶 cDNA cDNA S核酸酶1、mRNA的纯化： 真核细胞mRNA 3端有一多聚腺苷酸-polyA，用亲和层析法（亲和层析柱上有polyT）将mRNA从细胞中分离出来。2、cDNA的第一链合成： mRNA polyA 反转录酶 mRNA polyA DNA polyT 3、cDNA第二链合成： 用碱解或RNaseH酶解法除去cDNA-mRNA中的mRNA，再以 cDNA为摸板合成第二链，再用核酸酶S酶切除单链DNA。4、cDNA克隆： 克隆载体有：质粒DNA、噬菌体DN

13、A 载体转导或转化宿主细胞5、cDNA鉴定： 根据表型进行筛选如抗性基因失活法、菌落颜色变化等6、目的cDNA克隆的分离和鉴定： 分离方法：核酸探针杂交法： 根据目的基因蛋白质纯品aa序列分析，人工合成单链寡核苷酸 作为探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。 免疫反应鉴定法： 用某种蛋白质的抗体与文库cDNA表达产物发生免疫反应, 寻 找相应的特异 cDNA克隆。三、反转录-聚合酶链反应法四、化学合成法： 小的蛋白质或多肽的编码基因可以用人工合成， 有要求：五、构建基因文库法：（常用于原核生物基因） 基因文库： 步骤： 1、 2、 3、 六、新基因 第四节 目的基因载体 载体： 条件：

14、种类：一、质粒 1、含义： 2、分类： 根据能否在细胞间传递分： 根据在细胞中拷贝数不同分：3、制备 离心收获细菌，裂解细菌 裂解方法与质粒有关：二、噬菌体 噬菌体: 溶源生长： 溶菌生长： DNA作为载体特点：三、科斯质粒 科斯质粒： 特点：四、M13噬菌体 第五节 目的基因与载体的重组 体外重组：一、连接酶作用机制 DNA连接酶: 大肠杆菌DNA连接酶：二磷酸吡啶核苷酸为辅助因子 T4噬菌体DNA连接酶：ATP为辅助因子（多用） T4噬菌体DNA连接酶作用机制：二、连接反应作用方式 1、粘性末端连接 ECoR切割的目的基因 G CTTAA5 AATTC G ECoR G CTTAAG CT

15、TAAAATTC GAATTC G 连接酶 G CTTAAAATTC G 连接酶 ECoR DNA 重组体 EcoR2、钝端连接1）加同聚尾连接 末端脱氧核 苷酸转移酶 AAAA dATP AAAA TTTT TTTT DNA连接酶 2）加人工接头连接 GAATTC CTTAAG T4连接酶 GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAAG ECoR AATTC G G CTTAA三、连接时注意事项1、连接温度： 37最适合，但粘性末端氢键不稳定 12-15 过夜； 7-8 2-3天； 4 1周2、防止载体自身环化 1）载体与外源DNA的浓度和比例 载体：外源DNA=1：3 2）用碱性磷

16、酸酶处理载体 可水解5-磷酸 3）定向克隆： 第六节 目的基因的转化与感染常用宿主微生物有： 大肠杆菌 枯草杆菌 酵母菌应具备一定性能： 1）能够接受外源DNA 2）具有缺陷型 3）不适合在非培养条件下生存一、转化作用 转化： 转化机制：二、转导作用 转导： 局限性转导： 普遍性转导： 限制性转导：三、脂质体介导的融合作用 含义：第七节 目的基因重组克隆的鉴定与分析一、重组DNA的鉴定1、根据重组体表型进行筛选鉴定：（1）抗性基因失活法：（2）半乳糖苷酶基因插入失活法：2、重组体结构分析法：3、原位杂交法：（1）技术含义：（2）过程： 含转化体平板 硝酸纤维素膜 溶菌 碱变性 酸中和 洗涤 杂

17、交 洗涤 干燥 结合DNA膜 阳性菌落斑点 放射自显影 挑出阳性菌落 4、免疫分析法：（1）含义： 有放射性抗体和免疫沉淀测定法（2）放射性抗体测定法过程： 转化混合物培养 制备影印板 氯仿蒸气 结合抗体膜 第二抗体 放射自显影 干燥 洗涤 二、重组DNA的分析：1、重组质粒分离及再转化：2、限制酶分析：（1）双酶消化法： 含义： 用于构建物理图谱 例：由载体PBR322与海象染色体DNA片段构成PWAL1重组质粒，已知海象染色体DNA片段与载体PBR322各自只有一个Sal、EcoR酶切位点，故采用Sal和EcoR双酶消化分析PWAL1重组质粒，同时用载体PBR322双酶消化分析对照，构建物

18、理图谱。PBR322载体： 酶 片段 EcoR或 Sal 2.7EcoR+ Sal 2.3 0.4PWAL1重组质粒： 酶 片段 EcoR 4.1 2.7 Sal 4.2 2.6EcoR+ Sal 2.3 2.2 1.9 0.4PBR322载体： EcoR 酶切PWAL1重组质粒： EcoR EcoR Sal 2.3 + 0.4 EcoRSal 酶切PWAL1重组质粒： 4.1 + 2.7 Sal Sal 4.2+2.6 Sal+EcoR 酶切PWAL1重组质粒： EcoR Sal Sal EcoR 2.3 2.2 1.9 0.4（2）部分消化法： 含义： 0 2 5 10 15 20 6.5

19、(Kb) 5.0 3.5 3.0 2.0 1.5 3.0 2.0 1.5 6.5 (3)印迹转移技术： 限切酶 凝胶电泳 硝酸纤维素膜 凝胶 32 P-cDNA或 硝酸纤维素膜 32P-mRNA 硝酸纤维素膜 （4）再克隆技术：（5）转录-翻译系统： 小细胞系统： 大细胞系统： 无细胞系统：第八节 基因表达 基因表达：基因表达的主要研究内容： 基因表达的产量， 基因表达产物的稳定性， 基因表达产物的活性，基因表达产物的分离纯化一、宿主细胞的选择：标准：分类：原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌等真核细胞：酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等1、原核细胞：（1）大肠杆菌 优点：研究深入；生长迅速 表达

20、形式： 细胞内不溶性表达；细胞内可溶性表达；细胞周质表达；细 胞外表达。特点：（2）枯草杆菌：特点：其表达分泌能力强，表达蛋白分泌到培养液中（3）链霉菌：特点：2、真核细胞（1）酵母特点：基因组小；世代时间短；有单倍体和双倍体；可以大规模培养；无毒性。（2）丝状真菌特点：表达分泌能力强；可翻译后加工；安全无毒（3）哺乳动物细胞特点：产物易分离纯化；产物糖基化，类似天然产物；缺点：生产慢；产率低；条件苛刻；费用高二、基因表达基因表达有三种：1、大肠杆菌表达真核基因：启动子：阻遏子：终止子：SD序列：基因表达分三步： 获得真核目的基因 真核目的基因与载体重组 导入宿主细胞表达蛋白质（1）载体应具备

21、：要有强启动子、阻遏子、强终止子、产生的mRNA要有起始密码子AUG和SD序列（2）影响基因表达的因素外源基因的拷贝数：外源基因的表达效率： 影响基因表达效率的因素：表达产物的稳定性：细胞的代谢负荷：工程菌的培养条件：（3）真核基因在大肠杆菌中的表达形式以融合蛋白的形式表达： 原核多肽-真核蛋白 优点 ：以非融合蛋白的形式表达： 优点：分泌型表达蛋白质： 特点：2、酵母中的基因表达3、动物细胞中的基因表达第九节 基因工程菌的稳定性基因工程菌的不稳定性 载体质粒的不稳定性质粒的不稳定性：分裂不稳定性（常见）：结构不稳定性：质粒的不稳定性的危害：质粒发生变化的工程菌具有生长优势，培养时逐渐取代含有

22、正常质粒的工程菌，影响基因表达。一、影响质粒稳定性的因素（分裂不稳定性）1、含有质粒的工程菌产生不含质粒子代菌频率 频率越高越不稳定2、含有质粒和不含质粒的菌生长速率差异大小 不含质粒的菌生长越快越不稳定二、提高质粒稳定性的方法1、两阶段培养法：2、培养中加入选择性因素：3、还有控制培养条件改变含质粒和不含质粒菌的生长速率差异第十节 工程菌生长代谢特点 以大肠杆菌为例，蛋白质/菌体量比值基本恒定，菌体生长速度反映蛋白质合成速度。一、菌体生长与能量的关系呼吸提供的能量决定了菌体的生长速率。供能副产物乙酸抑制菌体生长。二、菌体生长与前体供应的关系前体供应充足保证菌体生长速率提高。第十一节 基因工程

23、菌的发酵基因工程菌的培养：（1）摇床培养（2）培养罐发酵一、培养方式：1、补料分批培养：2、连续培养：3、透析培养：4、固定化培养：二、工程菌的发酵工艺与传统微生物发酵工艺不同：（1）（2）（3）就培养过程来看影响基因表达的因素：1、培养基的影响（在基因水平对菌体生长、外基因表达进行控（1） 制和诱导如启动子的阻遏和诱导） （2）（3）培养基成分碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、 硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等无机盐：微量元素：维生素：生物素：特殊营养物：2、接种量的影响（影响表达产量和周期） 种子液体积和培养液体积的比例接种量小 不利于基

24、因表达接种量大 菌生长过快，代谢产物积累抑制菌生长3、温度影响（表现在复制、转录、翻译及物质合成） 通过酶影响的4、溶解氧的影响（影响菌体生长和产物合成）5、诱导时机6、pH影响三、培养设备主要组成发酵罐体、搅拌器、温度控制系统、灭菌系统、空气过滤系统、残留气体处理系统、参数测量与控制系统、培养液配制及连续操作装置第十二节 基因工程产物的分离纯化与产物的来源和特点有关基因工程产物多是活性肽和蛋白质，特点：（1）含量低（2）组成复杂（3）稳定性差（4）种类多（5）应用特殊要求一、分离纯化的基本过程 发酵液 细胞分离 胞内产物 胞外产物 细胞破碎 固液分离 包含体 细胞碎片分离 变性复性 浓缩 初

25、步分离 纯化 制剂 产品二、分离纯化技术基因工程药物来自于转化细胞，产品纯度要求高分离纯化技术要求：1、温和2、选择性好3、收率高4、步骤要少5、快第十四节 包含体的复性包含体:一、包含体的形成原因1、2、3、 包含体的优点二、包含体的分离和溶解1、包含体的分离2、包含体的溶解三、包含体蛋白复性方法包含体的复性：好的包含体蛋白复性方法具备：包含体蛋白复性方法：1、2、3、4、5、6、7、第十四节 基因工程药物的质量控制与传统生物制药相比，质量控制更为严格（1）药物是工程菌表达的大分子、结构复杂的蛋白质（2）药物是激素类样的物质，极微量就可以产生显著效果（3）人工构建的外源基因在表达过程中易发生

26、变化基因工程药物质量控制环节一、原材料外源DNA序列准确；宿主细胞为单一克隆；质粒纯且稳定二、培养过程菌种储存中；培养过程中；重复生产中三、纯化过程药物一致性；杂质在限量以下四、产品1、产品鉴别（1）肽图分析（2）氨基酸成分分析（3）部分氨基酸分析（4）相对分子量测定（5）二硫键分析2、纯度分析3、生物活性测定4、化学毒理学评价5、稳定性分析6、一致性分析五、产品保存1、液态（1）低温保存 -10-20冰冻（2）在稳定pH下 等电点附近（3）高浓度（4）加保护剂2、固态结晶或干粉与基因有关的药物第十五节 反义技术和反义药物正常转录中： 正义DNA (编码链、正)双链DNA 两条单链 反义DNA

27、（模板链、负） 蛋白质 mRNA 正义DNA RNA（反义RNA）（偶尔）在细胞中发现： 内源性 反义RNA mRNA 蛋白质 1978年根据病毒mRNA 序列人工设计、合成了互补于该mRNA 的13个碱基组成的寡聚脱氧核苷酸，研究发现它能抑制该病毒的复制，这种抑制作用是通过反义核酸机理实现的。 1981年第一次报道了天然反义RNA的生物学功能，发现在质粒DNA复制时，与引物RNA互补的RNA分子能抑制DNA复制。 1983年发现反义RNA 的调节作用，揭示了一种新的基因表达调节机制。 1998年美国FDA批准了第一个全球反义药物福米韦森上市，用于治疗爱滋病所致巨细胞病毒视网膜炎。 反义药物可

28、特异地作用于靶基因或mRNA ，从基因复制、转录、剪接、转运和翻译等各个环节上调控基因的表达，从而实现疾病的治疗。 一、含义： 反义技术： 反义核酸： 反义药物（信息药物）：二、反义核酸种类：1、反义DNA：2、反义RNA ： 合成：3、核酸酶： 合成：4、三链形成寡核苷酸（反基因策略）： 作用特点：5、多肽核酸： 其中反义RNA效率最高：反义核酸作为药物与常规药物相比具有的优点： 药物的研究与开发取决于两个参数：一个是确定疾病发展过程中的靶点，一个是发现能特异性识别并结合在靶点上的化合物，干预疾病的发展过程。过去常规药物作用的靶点大多是蛋白质、酶和激素。1、高度特异性：反义寡核苷酸与靶基因能

29、通过碱基配对原理发生特异和有效 结合,从而调节基因的表达。2、高效性：只需细胞内很低浓度。3、最优化的药物设计：作用靶点是基因，有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的，设计简单和 理性化。4、低毒、安全：与结合双链的高度特异性有关。5、合成 特异性反义核酸比较 容易。缺点： 天然寡聚核苷酸难以进入细胞内；细胞内容易被核酸酶水解；极短的血清半衰期；口服无活性。 很难直接用于治疗，现多为修饰的寡聚核苷酸。三、反义作用的靶点和机制： 大多反义核酸主要通过抑制翻译而发挥作用，但实际上反义核酸在细胞内多层次发挥作用。具体作用靶点：1、抑制DNA复制 反义RNA与引物RNA前体互补结合抑制DNA复制。2、抑

30、制转录 影响RNA聚合酶的作用；三链形成寡核苷酸可与基因DNA双链形成DNA三螺旋结构。3、抑制转录后过程 影响mRNA的成熟过程的步骤：剪接、成熟。4、抑制翻译机制 反义核酸可以结合到mRNA的翻译区，通过立体效应阻碍核糖体和重要蛋白质因子与mRNA结合或核糖体在mRNA上的移动，另外与mRNA结合后可激活内源核酸酶或核酶，降解mRNA抑制翻译过程。5、阻止成熟mRNA由细胞核向细胞质运输。 翻译水平上的调控是反义RNA的主要调控形式：在原核生物中反义RNA在翻译水平上有三种作用：（1）与mRNA5端非翻译区包括SD序列结合直接抑制翻译；（2）与mRNA5编码区主要起始密码子AUG结合抑制翻

31、译起始。（3）与靶mRNA非编码区互补结合，使 mRNA构象变化影响其与核糖体结合间接抑制mRNA翻译。作用机制：1、2、四、反义药物设计原理 mRNA 产生不适当或过量特殊蛋白质 疾病 反义药物（寡核苷酸） 激活 核酸酶H靶mRNA-反义药物（寡核苷酸） mRNA片段反义寡核苷酸药物药效 ： 透膜能力（由作用机制可见） 核酸酶耐受力 与RNA亲和力 核酸酶H激活 遵循的原则：1、寡聚核苷酸-靶序列复合物稳定2、此作用是专一的3、对抗核酸酶降解，半衰期要足够长4、穿过膜力 未改造的寡聚核苷酸有专一性和亲和性，激活核酸酶，使靶mRNA被降解，但不抗核酸酶降解和足够的透膜性，要通过改造加以实现，改

32、造包括：磷酸二酯骨架、杂环碱基和糖环，氢键骨架不能作大的改变。这些改造会影响专一性和亲和性，因此，改造难以同时满足上述要求。五、反义药物设计制备1、人工合成：反义脱氧核糖寡核苷酸同时修饰骨架、磷酸、糖环及碱基等化学修饰增加核酸酶抗性： CH2 O 碱基 X=H(DNA) H H X=OH(RNA) H X H O AB O CH2 O 碱基 H H H X H OH碱基碱基 ： H O P O 原磷酸二酯 HS P O硫代磷酸酯 RO P O 烷基磷酸酯 R2N P O烷氨基磷酸酯 CH2 亚甲基第一代药物：硫代磷酸寡聚核苷酸硫代磷酸盐（已经上市的是该类）第二代药物：混合骨架寡聚核苷酸，甲氧或

33、乙氧取代2羟基第三代药物：肽核酸，2-氨基乙基甘氨酸多聚体为骨架（1）磷酸 磷酸二酯键是核酸酶作用的关键化学键，而磷原子更是核酸酶攻击中心，对该 原子的轻微改变都会大大影响核酸酶的作用。 磷酸二酯骨架的改造可增强稳定性、亲和性和透过细胞膜能力。 磷原子被取代，甲基化 磷酸羟基被甲基、巯基、胺基和烷氧基取代，可改变离子特性，使其具有核酸酶抗性同时可以以被动转运的方式通过细胞膜。（2）骨架-多肽核酸 寡核苷酸链骨架是通过磷酸二酯键连接而成，其对核酸酶敏感，而反义寡核苷酸发挥其特异性抑制基因表达的关键在于其碱基排列顺序，而与易降解的磷酸二酯键骨架无关，因此可以用肽骨架等替换磷酸二酯键骨架解决核酸酶抗

34、性问题。（3）糖环有很多，如构型，天然DNA的 型核苷键换成构型，可以使核酸酶不能有效识别磷酸二酯键。（4）碱基 碱基是反义寡核苷酸与靶基因通过氢键形成而直接接触的部位，而氢键的形成又是反义寡核苷酸发挥作用的必要条件，所以此改变要慎重。 碱基修饰集团有甲基、三氟甲基、炔丙基等。2、生物合成：反义RNA 利用DNA重组技术构建人工反义基因表达载体， 转染后转录出反义产物，再与靶基因mRNA互补， 调控特异基因的表达。六、最佳反义药物的选择1、2、3、4、七、反义药物导入细胞的方法1、显微注射 法2、载体导入法3、被动扩散机制进入细胞法4、受体介导法5、脂质体包埋后导入细胞6、口服给药八、反义药物

35、作用特点1、特异性强，只阻断靶基因的表达2、安全,反义RNA不改变基因结构，最终会被RNA酶水解，不 整合。3、易操作，反义RNA可大量合成。4、可作成复合反义RNA，同时作用于数个靶点。5、反义RNA临床应用存在问题，如副作用。6、反义RNA与mRNA互补亲和力受其结构影响7、核酸酶设计要求高，限制其发展。九、反义药物的体外药理研究1、病毒病：封闭病毒基因。如麻疹病毒、流行性出血热病毒2、癌症：肿瘤发生与癌基因突变有关；也与抑制细胞正常凋亡有关。反义药物可封闭相关基因。3、神经系统衰老过程中，脑神经元的凋亡与有关蛋白表达增加相关。4、成骨不全是一类与胶原蛋白基因突变有关的遗传性功能紊乱。5、

36、耐药性多药耐药基因可引起敏感细胞的多药耐药。6、血管平滑肌 平滑肌细胞的迁移和增生是内膜增生的主要特征。与相关基因有关，反义药物可以防止冠状动脉再狭窄和血管成形术后的病人血管再狭窄。7、高血压十、反义药物待解决的问题1、安全性问题如第一代反义药物、大剂量给药动物死亡；、动物白细胞总数暂时性下降，血压、心率发生变化；、它与蛋白具有亲和性，影响蛋白正常功能；、在动物肝、肾和骨髓中聚集、沉积，长期效应不确切。2、专一性问题过量表达的失控基因只存在于特定组织器官中，在其他部位仍能正常表达，反义药物要专一作用于失控基因。3、稳定性问题在人体内对核酸酶不稳定4、反义药物副作用原因 三螺旋技术-抗基因核酸技

37、术 15-17个核苷酸长度的短寡脱氧核糖核苷酸特异结合到DNA双螺旋的互补区域上，形成三螺旋结构,抑制DNA复制。三螺旋技术与反义技术的区别： 1、三螺旋DNA所需剂量较反义RNA小得多； 因为它作用靶点在转录水平的DNA上，而反义RNA作用于转录后放大的mRNA水平。 2、三螺旋DNA特异性高； 3、半衰期短、稳定性不够。十一、寡核苷酸的非反义应用1、诱饵核酸（正义技术）模拟DNA位点合成双链寡核苷酸竞争结合转录调节因子抑制转录调节因子与启动子结合抑制转录2、免疫调节剂CpG DNA3、适体技术 适体是结合到蛋白质或其他小分子上的单链或双链的寡核苷酸序列。 它能够结合到蛋白质上如与转录因子结

38、合可阻断基因表达和蛋白质合成。4、DNA疫苗定义：给药方法： 1、裸DNA直接注射于肌肉、皮下、黏膜或静脉内；2、脂质体包埋注射；3、用基因枪注入组织内；4、用无害细菌作载体带入。DNA疫苗的优点： DNA疫苗的缺点：1、 1、2、 2、3、 3、4、 4、5、6、7、8、 5、 第十六节 基因治疗分子生物学和分子遗传学等 遗传疾病分子机理:基因缺失、重排、突变和基因的异常表达 遗传疾病 遗传疾病的分子机理模型变异的基因或异常表达基因 正常基因或正常表达基因 治愈遗传疾病 作为一种疗法，1973年代开始人体试验，2、7岁两姐妹体内缺少一种酶，精神痴呆。把携带酶基因的病毒注入体内，试图使酶分泌恢

39、复正常，但没有结果。 80年美国医生对两名地中海贫血患者进行基因治疗，结果也未成功。 80年代初，安德森阐明了基因治疗的前景和发展方向，之后，大批科学家进行了大量的动物实验，为基因治疗的临床应用奠定了理论基础。 90年用反转录病毒载体将基因导入肿瘤浸润淋巴细胞，并把它输回体内进行追踪，发现此细胞集中于肿瘤部位，并在半年后基因仍表达。90年9月14日FDA批准临床实验：患者缺失一个基因导致缺乏腺苷酸脱氨酶，此酶是免疫系统必须的。把此酶基因转入患者淋巴细胞后，经培养筛选出产生腺苷酸脱氨酶的淋巴细胞，再把的淋巴细胞转入患者体内，结果患者症状明显缓解 91年对黑色素瘤晚期患者进行基因治疗，把肿瘤坏死因

40、子基因转入淋巴细胞，结果淋巴细胞集中在肿瘤部位并杀死肿瘤细胞，治疗取得一定效果。 此后，对各种疾病都进行了基因治疗的临床实验，但有的成功，有的失败。一、定义： 缺点：二、分类：根据基因治疗靶细胞：1、2、三、治疗方式：1、矫正性基因治疗123 42、调控性基因治疗1反义技术A、B、C、2基因代偿基因治疗的其它方式1、2、3、四、基因治疗途径1、体外基因治疗靶细胞满足条件：12342、体内基因治疗两种方法比较：五、基因治疗中基因转移载体1、病毒载体1反转录病毒载体反转录病毒 反转录病毒基因组 反转录病毒生活周期 反转录病毒作为载体的优点反转录病毒载体 反转录病毒载体具备的条件 反转录病毒包装细胞

41、2腺病毒载体 优点：腺病毒载体系统使用原理： 缺点：还有：腺病毒相关病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、人工染色体2、非病毒载体 转移效率低，但无毒。非病毒转移法颗粒轰击、裸DNA直接注射、显微注射、电穿孔、磷酸钙共沉淀、阳离子脂质体。病毒增强转移法仙台病毒增强法六、基因治疗的靶向问题1、目的基因表达空间的定位 靶向载体 受体介导的基因转移 靶向反转录病毒载体 a、b、c、 靶向转录2、目的基因表达时序的调控 3、目的基因表达水平的调控七、基因治疗的步骤 1、分离出目的基因 选择原则： 2、选择载体和受体细胞 3、基因导入 4、外源基因表达八、基因治疗临床应用 1、遗传病： 2、肿瘤病作用方式：（1

42、）免疫基因治疗 1 2（2）自杀基因治疗（3）反义基因治疗 （4）多药抗性基因治疗（5）抑癌基因治疗 3、病毒病（1）（2） 1 2 3九、前景和存在的问题存在的问题：基因转移效率低，导入基因的表达难以调控，载体本身有缺陷。要作好基础研究：1、疾病发病机制；2、完善基因转移载体；3、研究基因的表达及其调控；4、建立良好的实验动物模型第十七节 人类基因组与药学 新药发现的基因组策略 人类基因组序列人类基因组计划： 确定基因序列 （结构基因组学）功能基因组学 ： 功能基因组学 鉴定某疾病相关的基因功能蛋白质组学： 生物信息学 ： 蛋白质组学/生物信息学 鉴定与某疾病有关的基因产物 蛋白质生产 生产

43、某疾病可能的靶蛋白 配体发现 鉴定在某疾病中与特定靶蛋白结合的分子 确认靶标 配体生物分析 配体最优化 证实在某疾病中起关键作用的蛋白质靶标 , 证实配体结合对蛋白质靶标的最佳影响， 对配体结构的适当修饰以达到最佳治疗效果 具有新的作用机制的药物 第四章 微生物工程制药微生物工程：微生物药物：现在微生物药物研究的特点：（1）（2）（3）（4）第一节 微生物药物产生菌培养概述一、微生物药物的产生菌1、细菌 球菌 螺旋菌 杆菌（常用）2、放线菌 来自放线菌的药物有： 抗菌药物及产生菌 （1）-内酰胺类抗生素产生菌 如硫霉素 （2）氨基糖苷类 如链霉素、卡那霉素、庆大霉素 （3）四环素类 如金霉素、

44、土霉素、四环素 （4）大环内脂类 如红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素 （5）糖肽类 如万古霉素 （6）多烯类 如黄曲霉素 （7）紫霉素 （8）其他抗生素类 具体如：链霉素-灰色链霉菌 土霉素-龟裂链霉菌 金霉素-金黄色链霉菌 氯霉素-委内瑞拉链霉菌 红霉素-红霉素链霉菌 庆大霉素-红色小单孢菌 卡那霉素-卡那霉素链霉菌 抗肿瘤药物： 蒽环类 糖肽类 烯二炔类和丝裂烷类 色霉素类放线菌是生产抗生素主要菌之一。3、酵母菌 代谢产物： 菌体内成分：4、真菌青霉素头孢菌素灰黄霉素 环孢菌素二、微生物药物产生菌的筛选、保存及改良1、筛选（1）筛选的一般要求110（2）筛选途径 1菌种机构 2自然界 3从生产过

45、程2、微生物菌种保藏 保藏目的： 保藏原理： 方法：（1）（2）（3）（4）（5）3、微生物药物产生菌的改良理论基础、研究对象、研究目的、研究内容改良的意义方法：（1）自然选育：（2）诱变育种物理诱变剂 紫外线、激光、-、 -、 X-射线、微波化学诱变剂 烷化剂（芥子气）、嵌合剂（溴化乙啶）、碱基类似物 亚硝酸、抗生素生物诱变剂 噬菌体 转座子：能够转移位置的遗传因子。（3）杂交育种 原生质体融合：概念：原生质体融合技术 1、基本过程2、融合亲本的选择3、促融因素 4、融合子的检出常用于菌种的改良。优点： 1 234 接合: 准性生殖：指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。（4）基因工程技术改

46、良菌种三、菌种的退化与复壮菌种的退化：菌种经过多次传代或长期保藏之后，由于自然突 变等原因，使细胞的遗传性状发生改变，造成菌 种不纯，生产能力下降的现象。菌种的退化的原因（1） 自发突变与回复突变 基因突变是菌种的退化的主要原因，传代次数越多突变率越高。（2）遗传不稳定性 DNA重建（3）细胞自身调节和修复 体内多条DNA修复途径（4）环境条件的影响防止菌种退化的措施（复壮）（1）单孢子的分离（2）减少传代次数（3）创造良好的培养环境（4）增加遗传稳定性 添加抗诱变剂（5）采取有效的菌种保藏方法四、微生物的培养及培养基1、微生物的营养要求培养基营养成分有： 碳源： 氮源： 无机盐和微量元素：

47、生长因子：培养基有： 根据培养基的物理状态有： 液体培养基：工业常用 固体培养基： 半固体培养基：根据培养基组成物质的纯度有： 合成培养基： 天然培养基：根据培养基的特殊用途有： 鉴别培养基 选择性培养基 基本培养基 加富培养基根据生产中的用途有： 孢子培养基 种子培养基 发酵培养基2、培养基组成及配制原则（1）工业用培养基的一般要求 1 2 3 4（2）配制原则 1 2 3 4 5第二节 微生物药物的生物合成一、微生物的代谢 1、微生物的初级代谢和次级代谢 初级代谢： 次级代谢： 2、初级代谢和次级代谢的关系二、微生物次级代谢产物生物合成的基本特征（1）（2）（3）（4）（5）三、微生物药物

48、生物合成的基本途径1、次级代谢产物的生源生源：（1）聚酮体（2）糖类（3）不常见氨基酸（4）非核酸的嘌呤和嘧啶碱（5）莽草酸（6）甲羟戊酸2、微生物药物生物合成的基本途径（1）前体聚合 （2）修饰（3）不同组分装配四、微生物药物生物合成的调节机制 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、第三节 微生物细胞培养技术次级代谢产物发酵特点： （1） （2） （3） （4） （5） （6）一、微生物细胞培养方法根据培养基分为1、固体培养法2、液体培养法 液体培养法根据通气方式不同有：（1）液体表面培养法（2）液体深层培养法 1 2 3二、微生物培养一般工艺流程 斜面 摇瓶 种子罐 发酵罐

49、培养基灭菌 培养基配制 培养基原料成品包装 精制 提取 无细胞澄清液 细胞分离 培养液 废弃 菌体三、种子培养 1 、含义 2 、种子应具备的条件及质量判断方法 3 、种子制备 4 、接种龄与接种量四、培养条件及工艺条件控制1、温度影响及控制2、pH影响及控制3、溶解氧的影响及控制4、菌种与培养基的混合程度 第四节 生物反应器及检测和控制系统一、概述1、定义：2、分类：（1）（2） 1 2二、微生物生物反应器1、微生物生物反应器在制造上的基本要求1234567892、类型（1）机械搅拌式发酵罐 组成： 1罐体 2 搅拌系统 3 加温和冷却系统 4 进出气系统 5 进出液系统 6 检测和控制系统

50、 7 管线和接头（2）自吸式发酵罐（3）鼓泡式发酵罐（4）气升式发酵罐：如图（5）基因工程发酵罐三、其它反应器四、检测和控制系统1、培养中需检测的参数 温度 搅拌速度 进出液流量 溶解氧 pH 罐压 液位 装液量 物料密度 物料浊度 物料黏度 氧化电位2、检测和控制方法（1）温度（2） pH （3） 溶解氧 （4）搅拌速度 （5）进出液流量第五节 微生物工程在医药工业中的应用一、微生物工程产品类型1、菌体2、初级代谢产物3、次级代谢产物4、生物活性大分子二、在医药工业中的应用可生产如下物质作为药物1、抗生素类（1）抗细菌（2）抗真菌（3）抗肿瘤（4）半合成2、氨基酸类3、核苷酸类4、维生素类5

51、、甾体类6、治疗酶及酶抑制剂抗肿瘤抗生素1、蒽环类天然类阿霉素 道诺霉素 洋红霉素 阿克拉霉素2、丝裂烷类丝裂霉素ABC-M它们都具有丫啶吡咯并吲哚醌主核。 丝裂霉素A、B具有抗肿瘤作用，但毒性大。丝裂霉素C活性最强。3、博来霉素-腐草霉素类4、色霉素-橄榄霉素类5、放线菌素类6、烯炔类7、吡喃并蒽醌类8、吡咯1，4苯并二氮杂 卓类酶抑制剂1、蛋白质代谢相关酶抑制剂微生物来源的蛋白质酶抑制剂多为低分子化合物。与凝血、溶栓、免疫应答疾病相关蛋白质酶有： 纤维蛋白酶亮肽素 胰蛋白酶抗痛素 糜蛋白酶糜蛋白酶抑素 弹性蛋白酶弹性蛋白酶抑素与消化溃疡、血压疾病相关蛋白质酶有： 胃蛋白酶胃蛋白酶抑素A 肾

52、素金属蛋白酶有 胶原酶放线酰胺素 还有糖代谢相关酶抑制剂 脂肪代谢相关酶抑制剂 其他酶抑制剂受体拮抗剂受体拮抗剂:受体：有：与血压调节相关的拮抗剂 血栓形成相关的拮抗剂 性激素相关的拮抗剂 炎症相关的拮抗剂 神经系统相关的拮抗剂免疫调节剂1、免疫抑制剂2、免疫增强剂 第五章 动物细胞工程制药第一节 动物细胞工程制药概述一、动物细胞工程1、定义：2、内容：（1）基因重组（2）细胞融合（3）细胞核移植（4）染色体改造（5）转基因动物（6）细胞大规模培养（7）分离纯化二、动物细胞工程应用于制药的意义三、动物细胞工程制药内容1、细胞制药2、转基因动物制药第二节 动物细胞的形态和生理功能一、动物细胞的形

53、态1、贴壁细胞:2、悬浮细胞:3、兼性贴壁细胞:二、动物细胞的生理特点1、分裂周期长;2、贴附生长;3、二倍体细胞寿命有限;4、对环境敏感;5、营养要求高;6、可翻译后加工.利用动物细胞生产药物的优缺点：第三节 生产用动物细胞的获得一、生产用动物细胞1、原代细胞系2、二倍体细胞系3、转化细胞系4、基因工程细胞二、生产用动物细胞的获得1、原代细胞系:2、二倍体细胞系:特点：（1）染色体组为2N（2）贴壁抑制（3）增殖能力有限（4）无致瘤性3、转化细胞系:4、基因工程细胞:三、细胞库1、原始细胞库（1）（2）（3）2、生产细胞库四、细胞凋亡1、细胞凋亡:2、细胞凋亡与细胞坏死的区别:3、细胞凋亡的

54、诱因:4、细胞凋亡的预防:第四节 动物细胞的大规模培养条件和培养基一、动物细胞的培养条件1、消毒2、水质3、pH4、渗透压5、温度6、空气二、动物细胞培养基的种类和组成动物细胞培养基的种类：1、天然培养基2、合成培养基血清作用：（1）生长因子（2）贴附、伸展因子（3）结合蛋白（4）脂肪酸、微量元素3、无血清培养基（1）无血清批之间差异影响（2）无病原微生物污染（3）供应充足（4）易纯化（5）毒性小（6）检测干扰小第五节 动物细胞的培养方法和操作方式一、动物细胞大规模培养的方法1、悬浮培养优缺点：2、贴壁培养优缺点：3、悬浮_贴壁培养（1）微载体:（2）包埋和微囊:（3）结团:二、动物细胞培养的

55、操作方式1、分批2、分批补料3、连续4、灌注第六节 动物细胞生物反应器及检测控制系统一、动物细胞生物反应器1、中空纤维2、透析袋或膜式3、固定床或流化床二、检测控制系统1、检测参数2、参数检测和控制方法（1）温度（2）酸碱（3）溶解氧（4）搅拌（5）进出液量第七节 动物细胞工程制药 用于植物和微生物难以生产的蛋白质类产品疫苗：细胞因子：第八节 转基因动物制药一、绪论1、定义：2、转基因动物与基因治疗的区别:3、转基因动物制药的意义：（1）生产新蛋白（2）生产量大（3）降低成本（4）具有天然活性二、转基因动物研究方法-目的基因的转移方法1、显微注射法以转基因鼠为例:步骤：（1）（2）（3）（4）

56、2、胚胎干细胞法(以鼠为例)胚胎干细胞的获得: 培养皿中培养 分离内层细胞团 胰蛋白酶处理鼠 胚细胞 加饲养层细胞培养富集 DNA载体转染 胚胎干细胞 胚胎干细胞 无饲养层培养 分化细胞检测筛选(正-负选择法) 转基因胚胎干细胞 培养 胚泡期胚胎 筛选子宫 嵌合小鼠 纯合转基因小鼠3、反转录病毒法:三、转基因动物生物反应器1、乳腺好处:2、膀胱好处：四、转基因动物的应用1、大动物制药大量生产天然蛋白质2、建立动物模型五、转基因动物技术应用前景（1）生产蛋白质（2）构建疾病动物模型（3）为器官移植创造条件（4）建立优良品种（5）研究哺乳动物细胞生命活动（6）挽救濒危动物六、基因敲除小鼠1、基因敲

57、除:2、方法:利用正负选择法:设计与靶基因序列有同源性的重组打靶基因载体结构: 载体 HSV-tk1 HB1 TG neo HB2 HSV-tk2 染色体 非特异整合 HSV-tk1 HB1 TG neo HB2 HSV-tk2 HSV-tk1 HB1 TG neo HB2 HSV-tk2 染色体 正确 同源重组HSV-tk1 HSV-tk2:不同的胸苷激酶基因(负选择基因) 胸苷激酶 9-鸟嘌呤 毒性化合物TG:转入基因(无效的等位基因)HB1 HB2:与整合位点两端区域同源的两段DNA片断Neo:新霉素磷酸转移酶基因(正选择基因) 抗新霉素七、特异基因的导入 与基因敲除相反的技术,是在基因

58、敲除的重组打靶载体上,插入一个特异基因,再转染ES细胞,经过正负选择法后,获得阳性ES细胞注入胚胎.基因敲除与特异基因的导入应用: 敲除过量表达的基因改善其引发的疾病; 敲除基因观察其对生命活动的影响; 在非必要区导入特异基因补充和修复突变的基因; 导入特异基因了解其对生命活动的作用; 用于调控功能基因的研究; 优良育种.八、遗传切除 也叫细胞切除或遗传切断,是选择地抑制特定细胞系或细胞类型在动物体内的生长,而不是抑制单个基因的活动,是分析细胞在体内的功能的办法. 第六章 抗体工程制药第一节 概述抗体的特性：抗体制药的历史： 常规（多克隆）抗体及缺点： 单克隆抗体： 基因工程抗体： 作为药物的

59、抗体：1、2、3、4、5、 特点：1、2、3、一、抗体1、抗体（常规抗体、 多克隆 抗体） ：第一代抗体抗原、半抗原、变应原、耐受原、免疫佐剂、免疫球蛋白免疫原性： 是指抗原可刺激和触发特定的免疫细胞活化、增殖和分化，并产生免疫效应物质（抗体或致敏淋巴细胞）的特性。免疫反应性： 是指抗原与相应的免疫效应物质在体内或体外再次相遇时，可发生特异性结合而产生特异性免疫反应的特性。 凡是具有免疫原性和免疫反应性的物质称为完全抗原。决定免疫原性的因素：抗体结构： VH（1） 可变区 互补决定区1、2、3（2）VL CH1 （CDR区）（3） 轻链 CL CH2 重链 恒定区 CH3 抗体结构抗体作用方式

60、：常规抗体存在的问题：2、单克隆抗体：第二代抗体（1）含义：（2）特点：（3）缺点：3、基因工程抗体：第三代抗体4、免疫偶联物与融合蛋白：抗体结构与功能具有两重性：免疫偶联物：融合蛋白：二、抗体的特异性抗体和抗原的特异性结合是抗体药物发挥作用的基础作为药物其特异性表现为：1、2、3、三、抗体的多样性是由以下因素决定的：1、抗原的多样性：2、抗体结构的多样性：3、抗体活性多样性：4、免疫偶联物与融合蛋白的多样性：四、制备抗体药物的定向性1、2、五、抗体药物研究的主要趋势1、研究新的分子靶点开发新药2、抗体的人源化3、抗体药物的高效化4、抗体药物分子的小型化5、具有抗体功能的融合蛋白第二节 单克隆