基因工程载体植物基因工程

1、关于基因工程载体植物基因工程第1页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四本章重点掌握的内容掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、-互补、插入失活、人工染色体载体的概念。 克隆载体DNA分子具备的条件。 标记基因的分类及其作用。 质粒克隆载体用途。 -DNA载体的构建、类型及其优点。 植物表达载体的组成、启动子的类型等第2页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四 遗传物质 + 载体 重组的DNA分子 引入细胞或生物体内 复制与表达 稳定地遗传给下代 为什么要用到载体？第3页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四基因工程流程图第4页，共

2、165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四为什么需要载体？ 1）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区（encoding region)和终止子（terminator)的基因，or 组成基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的； 2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。第5页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四载体的概念载体（vector) 基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，在很大程度上决定于载体 。第6页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，

3、星期四载体的功能载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 为外源基因提供整合能力 第7页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四 载体的要求A、复制起点：能在受体中复制；B、选择标记和筛选标记；C、限制性内切酶切割位点（多克隆位点）；D、载体的大小：原则上要求载体越小越好；E、适当的拷贝数；F、载体的安全性：质粒不能随便转移;G、外源基因的表达：启动子。第8页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四大肠杆菌质粒载体 pBR322结构图 复制起点 选择标记基因克隆位点克隆位点第9页，共165页，2022年，5月20日，8点16分

4、，星期四载体的分类按功能分类 克隆载体克隆一个基因或DNA片断 表达载体用于一个基因的蛋白表达 整合载体把一个基因插入到染色体组中 按来源分类 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 人工染色体载体 第10页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四载体的种类和特征质粒受体细胞结构插入片断举例 E.coli环状 8kbpUC18/19 , pBR322等 噬菌体载体E.coli线状9 - 24kb EMBL系列， gt系列丝状噬菌体及噬菌粒载体E.coli环状 10 kbM13mp系列粘粒载体载体E.coli环状35- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/

5、16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome)载体E.coli环状300 kb pBeloBAC11YAC (Yeast Artificial chromosome )载体酵母细胞线性染色体 100 - 2000 kbpYAC4MAC (Mammalian Artificial Chromosome)载体哺乳类细胞线性染色体 1000 kbpCXLamIntWT, pCXLamIntR and pCXLamIntROK病毒载体动物细胞环状SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体穿梭载体动物细胞 和细菌环状pSVK3质粒，PBV, Ti质粒第11页，共165

6、页，2022年，5月20日，8点16分，星期四第一节 克隆载体第12页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、质粒载体1.质粒的概念 质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状双链DNA 分子，可自主复制和表达。 并不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力（带有抗性基因等） 。 分子量在1-200kb之间 。第13页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、质粒载体大肠杆菌的质粒第14页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体2.质粒的空间构型 共价闭合环状DNA（Covale

7、nt close circular DNA，cccDNA) 呈超螺旋（SC）（super coil） 第15页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。 线形DNA （ linear ，LDNA）第16页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四第17页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。 SC OC L 第18页，共165页，202

8、2年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体3.质粒的基本特性 质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid） (拷贝数少，为1-5个)和松弛型复制控制的质粒（relaxed） (拷贝数多，可达10-200个拷贝) 因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 质粒 复制子 拷贝数 pBR322 及其衍生质粒 pMB1 1520 pUC 系列质粒及其衍生质粒 突变的 pMB1 500700 pSC101

9、 及其衍生质粒pSC101 5 ColE1ColE11520第19页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、质粒载体质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性) 两种质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相同的复制子。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 第20页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体质粒

10、的可转移性 接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用。 值得注意的是，某些非接合型质粒在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 mob、tra 基因、顺式作用原件bom及其内部的转移缺口位点nic决定。第21页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体Tra protein from conjugative plasmidbom siteMob genemob mRNAMob proteinopen recipient cellhelper plasmid即mob基因的

11、产物可打开非接合质粒的oriT位点，借助接合质粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用(mobilization)。质粒的可转移性第22页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、质粒载体大肠杆菌接合（conjunction）质粒DNA的tra基因E.Coli产生菌毛宿主与受体细胞结合遗传物在细胞之间转移（指令）（迁移）第23页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基 因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 抗生素、重金

12、属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义第24页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体遗传标记基因 定义:在基因工程中用来筛选导入了重组DNA的细胞的基因。 选择标记基因、筛选标记基因标记基因的作用 1. 指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 2. 指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子 第25页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体遗传标记基因的种类 1. 抗性标记基因（可直接用于选择转化子） a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr

13、，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cdr c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因 2. 营养标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。 3. 生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ（-半乳糖苷酶）， GUS（葡萄糖苷酸酶），CAT（过氧化氢酶） 第26页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体第27页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星

14、期四一、 质粒载体抗药性标记选择(插入失活法) 第28页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体常用的筛选标记基因 -半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZ） 一种能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶。 -半乳糖苷酶基因的优点: a.催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZ编码5-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZ和链基因的分别表达可使载体小而容量大 第29页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体互补（蓝白班筛选）野生型大肠杆菌产生的-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)

15、切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。-半乳糖苷酶缺陷型菌株中编码-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz的基因，lacz中包括：一段-半乳糖苷酶的启动子；编码肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的肽链和菌株基因组表达的端缺陷的-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即-互补。操作中，添加IPTG(异丙基硫代-半乳糖苷)以激活lac

16、z中的-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。当外源DNA（即目的片断）与含lacz的载体连接时，会插入进MCS，使肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无互补作用，不产生活性-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。第30页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体 P LacZ LacZ 转录 翻译 LacZ基因的结构与产物第31页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体lacZ -半乳糖苷酶分解乳糖i P O 调控蛋白P 大肠杆菌的-半乳糖

17、苷酶基因lacZ系统第32页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体lacZ -半乳糖苷酶-分解乳糖i P O 调控蛋白P -肽段分解X-gal产物呈现蓝色诱导剂IPTGa-互补显色反应（蓝白斑筛选）-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15 ？第33页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体X-galX-gal-peptideC-terminus of b-galactosiase 第34页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体互补显色反应 第35页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一

18、、 质粒载体-互补(-complementation) 第36页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体常用的筛选标记基因 葡萄糖苷酸酶基因（GUS） 该基因编码一种可分解各种-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。 荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。 发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白

19、质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。 第37页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体4.质粒的命名原则 人工组建的质粒 人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。如pBR322，字母p代表质粒，BR是构建该质粒的研究人员的姓名，322代表构建的一系质粒的编号。 第38页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体 5.质粒载体的发展概况 第一阶段（1977年前）天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, ColE1, pCR,

20、pBR313和pBR322。 第二阶段增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 第三阶段完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。第39页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体6.质粒载体构建 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的： pSC101 8.8 kb

21、 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr ColE1 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1 RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Ampr 第40页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体 第一个用于基因克隆的天然质粒, 克隆位点少，Tetr 作为筛选标志。 第41页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四A、删除不必要的DNA区域: 尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。B、减少限制性酶切点: 缺失突变，限制性酶、核酸外切酶和连接酶的共同作用，质粒之间的重组等方法。C、加入易于识别

22、的选择标记：通过质粒之间的重组，可以使质粒带有合适的选择性标记。D、安全性能改造：质粒载体不能在细菌之间随便转移。E、改造或加入基因表达的调控序列：启动子。质粒的改造第42页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四pBR322:4.3KbApr/TcrPstI/BamHI、SalI/HindIII、EcoRI一、 质粒载体第43页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体7.质粒载体的分类 人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因 低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10

23、表达某些毒性基因 温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质 测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker 整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合 穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆 表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件 探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选 第44页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体8.常用质粒载体 （1）pBR322 复制起点 ori：pMB1系列（来源于ColE1）高拷贝型复制起点 Ampr基因：pSP2124质粒的Ampr基因 Tetr基因：p

24、SC101的Tetr 基因。 长度：4363bp 选择标记：氨苄青霉素和四环素抗性。 克隆位点：含有多个克隆位点。 Ampr基因内可被Pst I，Pvu I，Sac I切开，而Tetr基因可被BamH I，Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。第45页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体第46页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四pBR322质粒载体优点：第一，具有较小的分子量 4363bp。第二，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 第三，具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积10003000个拷贝。一

25、、 质粒载体第47页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体（2） pUC系列质粒载体 在pBR322的基础上改造而成。其组成如下： 含有pBR322完整的Ampr基因和复制起始点。 含有大肠杆菌 -半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码 -肽链的DNA序列，即lacZ基因。 在lacZ基因中靠近5端的一段有MCS区段，但并不破坏该基因的功能。 pUC18、pUC19 第48页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四生命科学学院一、 质粒载体第49页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体pUC质粒载体的优点： 具有

26、较小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达500-700个拷贝。 适用于组织化学方法检测重组体，有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用，在IPTG诱导和底物X-gal存在下，形成蓝色和白色菌落筛选重组体。 具有MCS区段，便于外源基因的克隆。第50页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体（3）穿梭质粒载体(shuttle vector) ： 这种质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞中复制并检测，如大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒等。第51页，

27、共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、质粒载体TA克隆载体(补充) 用Taq酶的PCR产物3端加上了一个A。根据这一特点研制出一种线性质粒，其5端突出的T，它们之间可以连接，即TA克隆。 再生TA克隆载体的方法：克隆载体的线性化克隆载体末端补平克隆载体末端加T第52页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四一、 质粒载体第53页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体噬菌体（Bacteriophage）即细菌病毒，是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称。其核心是一段DNA(线性)，外围有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上

28、的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。第54页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体 噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为： 1.高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞； 2.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。 第55页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体(一)噬菌体的生物学特性 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体； 噬菌体由外壳包装蛋白和-DNA组成； DNA在噬菌体中是双链线状DNA分子，全长 48.5kb，有60多个基因，其中有1/3的区域是其裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区

29、段中插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是噬菌体可作为基因载体的依据 。 cos位点（cohesive end site): 在DNA两端各有12nt的5单链突出(5-GGGCGGCGACCT-3) ，彼此序列互补。它是包装时的切割信号。 第56页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体噬菌体的生活周期第57页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体粘性末端：12bp的互补单链 当噬菌体进入寄主细胞内后, 其粘性末端能通过碱基互补作用, 形成环状DNA分子。粘性末端形成的双链区域称为cos位点, 它是包装蛋白的识别位点。 噬菌体

30、的包装与DNA特性和其它序列无关, 但对包装的DNA大小有要求, 包装范围大约在36kb-51kb。 第58页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体噬菌体作为构建载体材料的依据：噬菌体是一种温和噬菌体； 能承载比较大的外源DNA片段；在噬菌体分子上有许多限制性核酸酶识别位点，便于多种DNA酶切片段的克隆。第59页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体(二)构建噬菌体的基本原理 (1)噬菌体的缺陷： 基因组太大（48.5kb）； 酶切点太多，它有5个BamH1位点（GGATCC），6个Bg位点（AGATCT），5个EcoR位点（GA

31、ATTC）。 野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于噬菌体的75-105%，那么只能接纳48.5kb5%=2.425kb的DNA。 重组的DNA分子难于直接导入宿主细胞，需在体外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNA。第60页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体(三)构建噬菌体的基本内容 构建噬菌体克隆载体的基本策略： 切去部分非必须的区域； 抹去多余的限制性内切酶切割位点； 插入可供选择的标记基因； 建立体外包装系统。第61页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体选择标记 (1) imm434 imm434基因编码一种

32、阻止-噬菌体进入裂解循环的阻遏物。含有完整标记基因的-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。 第62页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体选择标记 (2) lacZ LacZ基因编码-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体-DNA则产生蓝色透明斑。 第63页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体选择标记 (3) cI基因 cI基因的表达促进噬菌体进入

33、溶原状态， cI基因产物活性受到影响会促进噬菌体进入裂解循环。hfl （high frequency of lysogenization）高频溶原突变突变的大肠杆菌 。 第64页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体(四)噬菌体载体的类型 （1）插入型载体 只有12种限制性核酸内切酶的单一切割位点 筛选标记基因：-半乳糖苷酶基因 、cI基因第65页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体（1）插入型载体 载体长度37kb插入位点体外包装插入片段大小：0-14kb（5137）插入片段体外包装第66页，共165页，2022年，5月20日

34、，8点16分，星期四二、噬菌体载体gt10 载体 cI基因内有一个EcoR I位点第67页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体(四)噬菌体载体的类型 （2）替换型载体 在其中央部位有一个可以被外源DNA分子取代的DNA片段的克隆载体 。如： EMBL3第68页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四生命科学学院二、噬菌体载体第69页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体Spi筛选野生型噬菌体在带有P2原噬菌体的溶原性E.coil的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感。这种生长抑制作用是受噬

35、菌体red和gam这两个基因编码的产物控制的。如果噬菌体缺少两个参与重组的基因red和gam，同时带有chi位点，并且宿主菌为rec+，则可以在P2溶原性E.coil中生长良好，噬菌体的这种表型称作Spi-。因此，通过噬菌体载体DNA上的red和gam基因的缺失或替换，可在P2噬菌体溶原性细菌鉴别重组和非重组噬菌体。第70页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体插入型载体替换型载体red gam第71页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体(五)常用的噬菌体载体 （一） 半乳糖苷失活插入型载体 （二） 免疫功能失活插入型载体 （三

36、） Charon系列取代型载体 （四） EMBL系列取代型载体 （五） Spi-正选择取代型载体 （六） ZAP插入型载体 第72页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体(六)Lambda 噬菌体载体的克隆原理及步骤 第73页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体(七)-DNA重组分子的体外包装 噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后将重组DNA通过噬菌体导入E.coli细胞内。 这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组-DNA分子混合后，包装

37、才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。第74页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体D基因缺失的噬 菌体突变株（D-） E基因缺失的噬 菌体突变株（E-） E proteinD protein重组DNA（裂解物）（裂解物）infectassembleBHB2688-E- 的溶原菌BHB2690-D- 的溶原菌噬菌体的体外包装系统 第75页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体-DNA作为载体的优点 -DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 -D

38、NA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组-DNA分子的筛选较为方便 重组-DNA分子的提取较为简便 -DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因 第76页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体M13、f1、fd都为丝状单链DNA噬菌体。 优越性： 单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式的 DNA简称RF DNA； 2. 不论是RF DNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌； 3. 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多寡制约的，不存在包装限制问题； 4. 容易测定外源DNA片断的插入取向； 5.

39、可产生含外源片断的单链DNA分子。第77页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体 M13噬菌体载体 M13噬菌体是一种含单链（+）环状DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。用作载体时利用其双链状态的RF DNA。 这类载体主要用来获得大量的单链DNA片段，主要用来测定DNA序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。第78页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体 M13噬菌体的特点 感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型DNA （ replication for

40、m DNA, RF DNA）。可以象质粒DNA那样在体外进行纯化和操作。 丝状噬菌体颗粒的大小是根据其DNA的大小决定的，这一点正好与噬菌体相反，所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。 第79页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体 M13噬菌体产生单双链DNA的机制 1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（）链，该双链称复制型DNA（RF DNA）。 2、RF DNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。 3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA 。 4、游离出来

41、的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。 第80页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体第81页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体第82页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体第83页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体第84页，共165页，2022年，5月20日，8点1

42、6分，星期四二、噬菌体载体插入一段lac DNA片段，即带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列及其N端头146个aa编码信息，宿主F因子携带缺失第11-41位氨基酸的lacZ M13mp 载体系列第85页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四二、噬菌体载体单纯以噬菌体为基础构建的载体: 装载量大， 能排斥空载体， 转染效率高, 操作较难， DNA不稳定。 单纯以质粒为基础构建的载体: 有天然的抗性选择标记， 操作容易（易于分离和转化）， 较稳定, 装载量小， 转化效率较低； 第86页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四三、噬菌体-质粒杂合载体 (一)黏

43、粒(cosmid)载体 也称柯斯质粒载体、粘粒。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。 第87页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四三、噬菌体-质粒杂合载体黏粒载体的基本特点 具有噬菌体的特性(体外包装，高效感染等)； 具有质粒载体的特性

44、(易于克隆操作、选择及高拷贝等)； 具有较高容量（45 kb）的克隆能力； 具有与同源性序列的质粒进行重组的能力。 不能体内包装，不裂解受体细胞，在细胞内不能形成噬 菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑 。第88页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四三、噬菌体-质粒杂合载体第89页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四三、噬菌体-质粒杂合载体应用黏粒作载体进行基因克隆的一般程序第90页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四三、噬菌体-质粒杂合载体黏粒载体的克隆原理及步骤 1分离外源DNA片段3545kb 2外源DNA与两个粘粒相连，且cos方向相

45、同 3体外包装：在的A蛋白的功能作用下切割cos位点并将其中的DNA包装到成熟的噬菌体颗粒中去 4感染E.coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos位点的环化，而形成粘粒载体，象质粒一样复制第91页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四三、噬菌体-质粒杂合载体常用黏粒载体结构图 79第92页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四三、噬菌体-质粒杂合载体缺点：A、多个Cosmid 分子自连，降低阳性率；B、多个DNA分子同时插入，失真。第93页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四三、噬菌体-质粒杂合载体(二) 噬菌粒载体 由质粒载体和

46、单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。 第94页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四三、噬菌体-质粒杂合载体常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119 1. 具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可 克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作； 2. 编码一个ampr基因作为选择记号，便于转化子的选择； 3. 拷贝数含量高，每个寄主可高达500个； 4. 存在着一个多克隆位点区

47、； 5.可进行蓝白斑筛选；第95页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四三、噬菌体-质粒杂合载体6. 插入的外源基因以融合蛋白质的形式表达； 7. 含有质粒的复制起点，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子；8. 带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中； 9. 在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA； 10. 可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序

48、列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。第96页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四三、噬菌体-质粒杂合载体第97页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四三、噬菌体-质粒杂合载体pBluescript噬菌粒载体 基本结构： 1. 在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动； 2.同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的DNA； 3.编码有一个氨苄青霉素抗性基因，供作转化子记号； 4.含有lacZ基因，可

49、用Xgal-IPTG组织显色反应法筛选噬菌粒载体。第98页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四三、噬菌体-质粒杂合载体用于体外转录pBluescript噬菌粒载体T7T3第99页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四四、人工染色体及其应用 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段， 此时柯斯质粒(45kb)和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体， 它能像天然染色体

50、那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 第100页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四四、人工染色体及其应用 人工染色体载体（artificial chromosome vector）:利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。 实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)源质粒复制起始位点(ori)，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。 与其他的克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。 第101页，共165页，2022年

51、，5月20日，8点16分，星期四四、人工染色体及其应用 (一)酵母人工染色体 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)是一类酵母穿梭载体。 YAC具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。可以接受350-400kb的外源DNA片段。 四膜虫的端粒序列 酵母染色体的复制子 酵母染色体的着丝粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记第102页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四四、人工染色体及其应用(一)酵母人工染色体酵母人工染色体的使用第103页，共165页，2022年，5月20日，8点16分

52、，星期四四、人工染色体及其应用 用pYAC3进行克隆策略如下： 载体用BamHI和SnaBI双酶切，形成3个片段。 移去BamHI之间的片段，留下另外两段，每一段的两端都分别是TEL序列和SnaBI位点。 被克隆的DNA，两端必须切成平末端(SnaBI是一个平末端内切酶，识别TACGTA序列)。 把三者连接起来，形成了人工染色体。 用原生质转化的方法把人工染色体转入酿酒酵母。用作宿主的菌株是双营养缺陷型Trp1-ura3- ，可以被人工染色体上的筛选标记基因恢复成Trp1+ura3+ 。 在基本培养基平板上培养，只有含有结构正确的人工染色体的转化体可以生存。 如果染色体构建错误，如在被克隆的D

53、NA两侧连接了相同的两段载体DNA片段，则因缺少一种筛选标记，使得转化体不能在基本成分培养基上存活。 外源DNA的是否插入，可由SUP4的插入失活判断，即可以很简单地由菌落的颜色看出：红色的菌落是重组体，而白色的菌落则不是。第104页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四四、人工染色体及其应用(一)酵母人工染色体酵母人工染色体的使用pYAC3第105页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四四、人工染色体及其应用 (二)细菌人工染色体 细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构

54、建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间。 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 缺点：会出现插入片段在结构上的不 稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。第106页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四四、人工染色体及其应用 (三)P1噬菌体人工染色体 结合了 P1 载体和 BAC 载体的最佳特性，包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。 sacB：蔗糖果聚糖酶 第107页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四 第二节 表达载体第108页，共165页，2022年，5月

55、20日，8点16分，星期四第二节 表达载体克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可； 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。 第109页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四第二节 表达载体第110页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四第二节 表达载体表达载体构建的一般原则 1.阅读框架与外源基因高效表

56、达 2.启动子与外源基因高效表达 3.转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达 4.有效的翻译起始与外源基因高效表达 5.终止密码子选择与外源基因高效表达 6.外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达第111页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四第二节 表达载体真核基因在原核细胞中表达，载体必须具备的条件： 载体能够独立复制，具有复制起点。 应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆 鉴定和筛选。 应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。 应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为

57、稳定。所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD(Shine-Dalgarnosequence)序列，以便转录后顺利翻译。第112页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四第二节 表达载体大肠杆菌表达载体的基本成分第113页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四第二节 表达载体启动子：影响表达效率的主要因素之一是启动子的强弱。 常见启动子见下表。 启动子的强弱取决于启动子本身的序列，尤其是10和35区的碱基组成及彼此的间隔长度，同时也与启动子和外源基因转录起始位点间的距离有很大关系。第114页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四第二

58、节 表达载体启动子-35 区序列-10 区序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T P traA T A G A C A T A A T G T P lLT T G A C A G A T A C T P recAT T G A T A T A T A A T 启动子第115页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四第二节 表达载体 最佳启动子具备的条件： 第一 必须是强启动子 第二 启动子应是诱导型的（热或化学诱导）第116页，共165页，2

59、022年，5月20日，8点16分，星期四第二节 表达载体强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。终止子 强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA 操纵子上的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。 对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。第117页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四第二节 表达载体 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与 m

60、RNA 的翻译起始效率密切相关。 大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。 mRNA 翻译的起始效率主要由其 5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS） 核糖体结合位点第118页，共165页，2022年，5月20日，8点16分，星期四第二节 表达载体大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个部分： 位于翻译起始密码子上游的 68 个核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3 端区域 3 AUUCCUCC 5 并与之专一性结合，将mRNA 定位于核糖体