微生物实验课件

1、微生物实验报告微生物实验报告食品微生物检测 菌落总数测定一、实验原理： 1、培养基原理 平板计数琼脂培养基 ：胰蛋白胨提供碳源和氮源；酵母浸粉提供B族维生素；葡萄糖提供能源；琼脂是培养基的凝固剂。 食品微生物检测 菌落总数测定一、实验原理：2、细菌最适生长环境 a、多数细菌的最适温度范围基本相似，多为37左右 b、pH细菌对PH的适应范围较大为pH2.08.0，但多数细菌的生长最适PH为6.08.0 c、根据细菌对氧气的需要可分为4类；需氧菌微需氧菌、兼性厌氧菌、厌氧菌、所以培养需氧细菌时，需要高氧分压的环境，而培养厌氧细菌对，就要降低并严格控制环境中的氧分压 2、细菌最适生长环境3、细菌的菌

2、落特征 一般呈现较湿润、较光滑、质地均匀，且菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致3、细菌的菌落特征4、菌落总数测定中的注意事项41 所用器皿及稀释液411 检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试 管、移液器的吸头等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。412 用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时，要查找原因，如可通过追加对照平板，以判定是空白 稀释液，用于倾注平皿的培养基，还是平皿、吸管或空气可能存在的污染。4、菌落总数测定中的注意事项413 检样的稀释液一般用灭菌盐水，如果对含盐量较高的食品(如酱品等)进行稀释，则宜用蒸馏水。做醋

3、时用20 一30 碳酸钠调pH 至中性。413 检样的稀释液一般用灭菌盐水，如果对含盐量较高的食 实验流程图 实验流程图实验步骤样品：酸菜汤1 样品的稀释1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质1 min2 min，制成1:10 的样品匀液。1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。实验步骤样品：酸菜汤1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10

4、样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，制成1:100 的样品匀液。1.4 按6.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。1.5 根据对样品污染状况的估计，做5 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做3个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入1个无菌平皿内作空白对照。1.6 及时将15 mL20 mL 冷却至46 的平板计数琼脂培养基（可放置于46 1 恒温水浴箱中保温）倾注

5、平皿，并转动平皿使其混合均匀。1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀2 培养2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 1 培养48 h2 h。2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。2 培养6.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。6.3.1 选取菌落数在30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30

6、 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用3个平板的平均数。6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。6.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器实验结果（如图）浓度梯度为1:10实验结果（如图）浓度梯度为1:10浓度梯度为1:100浓度梯度为1:1000浓度梯度为1:100浓度梯

7、度为1:1000浓度梯度为0.0001浓度梯度为0.00001浓度梯度为0.0001浓度梯度为0.00001数据处理： 浓度梯度试管0.10.010.0010.00010.000011多不可计多不可计多不可计34 22多不可计多不可计多不可计2213多不可计多不可计多不可计342数据处理： 浓度梯度0.10.010.0010.实验结论：根据实验结果计算得样品中的菌落总数：N=（34+22+34）/310000 =300000实验结论：根据实验结果计算得样品中的菌落总数：实验结果分析 本次实验样品取自某食堂的免费汤水，从本次的实验结果可见，如果忽略实验误差，某食堂免费的汤水不符合卫生标准。实验结

8、果分析 本次实验样品取自某食堂的免费汤水，从实验三 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法培养基原理：1.月桂荃硫酸盐胰蛋白际(LST)肉汤：胰蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求；氯化钠可维持均衡的渗透压；乳糖是大肠菌群可发酵的糖类；磷酸二氢钾和磷酸氢二钾是缓冲剂；月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群细菌的生长2.煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤：蛋白胨提供碳氮源；乳糖是可发酵的糖类；牛胆粉和煌绿抑制非肠杆菌科细菌。3. EC肉汤：胰蛋白胨提供碳氮源；三号胆盐抑制革兰氏阳性菌，特别抑制革兰氏阳性杆菌和粪链球菌；乳糖是可发酵的糖类；磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为缓冲剂；氯化钠可维持均衡的渗透压。4.

9、伊红美蓝琼脂(EMB）：蛋白胨提供碳源和氮源；乳糖是大肠菌群可发酵的糖类；磷酸氢二钾是缓冲剂；琼脂是培养基凝固剂；伊红和美蓝是抑菌剂和pH指示剂，可抑制革兰氏阳性菌，在酸性条件下产生沉淀，形成紫黑色菌落或具黑色中心的外围无色透明的菌落。实验三 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法5.营养琼脂斜面：蛋白胨和牛肉粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；琼脂是培养基的凝固剂。6.色氮酸肉汤：胰 酪胨提供碳源和氮源满足细菌生长需求7. MR-VP培养基：月示胨提供碳氮源、维生素和生长因子；葡萄糖为可发酵的糖类；磷酸氢二钾是缓冲剂；氯化钠维持均衡的渗透压。 甲基红（MR）试验：肠杆菌科的细菌在糖代

10、谢过程中，分解葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，生成甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸。大肠杆菌分解丙酮酸，次生的酸类较多，pH为4.5或更低，甲基红呈现红色（阳性）。在产气杆菌的培养液中一部分丙酮酸变为中性的乙酰甲基甲醇，生成的酸类较少，pH在5.4以上，甲基红呈现桔黄色（阴性）。 乙酰甲基甲醇生成试验（VP试验）：细菌发酵葡萄糖生成丙酮酸，某些细菌可使丙酮酸脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性溶液中，乙酰甲基甲醇可在空气中氧化成二乙酰（丁二酮）。二乙酰再与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物。试验中加入萘酚是作催化剂，使反应的颜色加深，提高反应的敏感性。8.结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)：蛋白胨和酵

11、母粉提供碳氮源和微量元素；乳糖是可发酵的糖类；氯化钠可维持均衡的渗透压；胆盐和结晶紫抑制革兰氏阳性菌，特别抑制革兰氏阳性杆菌和粪链球菌；中性红为pH指示剂。5.营养琼脂斜面：蛋白胨和牛肉粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料。 当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。而产气杆菌则形成呈棕色的大菌落 伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料。 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它

12、不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫革兰氏染色的步骤a. 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。b. 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。c. 滴加95%乙醇脱色约15-30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。d. 滴加复染液，复染1

13、min，水洗、待干、镜检。结果 :革 兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。革兰氏染色的步骤实验步骤4、 样品稀释 所用样品：酸菜汤4.2.1液体食品 以 灭 菌 吸管取样25mL放入装有225m1无菌水的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以30cm幅度、于7s内4.2.2 固振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成1:10的样品匀液。固体和半固体食品 以无 菌 操 作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，干8000r/min均质1-2min，制成1 : 10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。实验步骤4、 样品稀释固体和半固体食品5.大肠茵群的测定5.1 大肠菌群M

14、PN值的测定5.1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白脉(LST)肉汤，每管接种1mL.5.1.2 将接种管置于36士1培养48士2h,5.1.3 观察试管的产气情况:检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h Ta 48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性;如有产气者，则进一步作证实试验。5.大肠茵群的测定5.2 大肠菌群的证实试验5.2. 1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。5.2.2 置BGLB肉汤管于36士1C培养48士2h,5.2.3 记录所有BGLB

15、肉汤管的产气管数。5.2.4 结果报告:按BGLB肉汤产气管数，查MPN表见附录B(补充件)报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。5.2 大肠菌群的证实试验48h观察结果 bglb产气情况从右图可知，浓度梯度1:10、1:100、1:1000每个梯度的三根管都产气。最右边一根为空白管。48h观察结果 bglb产气情况从右图可知，浓度梯度1:10实验结论：查MPN表得，每毫升样品中大肠杆菌群的MPN值为:mpn 1100实验结论：查MPN表得，每毫升样品中大肠杆菌群的M6 粪大肠菌群测定6.1 用直径为3mm的接种环将所有48士2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。6.2 将所有

16、接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.510.5水浴箱内，培养24士2h 水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5产气阳性的大肠杆菌和44.5 C不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。6.3 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性;不产气管为粪大肠菌群试验阴性。6.4 结果报告;按产气管数，查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌4的MP值。6 粪大肠菌群测定24h观察结果（EC肉汤产气情况）浓度梯度为0.10.001的样品均产气。24h观察结果（EC肉汤产气情况）浓度梯度为0.10.00结论： 本次报告样品检测各个稀释梯度均产气。 查MPN表

17、得：每mg样品中粪大肠杆菌群MPN值1100.结论：7.大肠杆菌测定7.1 将6. 3条中的EC肉汤管继续培养24h，取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板，36士IC培养24士2h,7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。7.3 如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落;如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落.用接种针接触菌落中心部位.移种到营养琼脂斜面上，36士1培养18-24h,7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。7.4.1一色氨酸肉汤:在36士1培养24士2h后，加Kovacs氏试剂。2-0.3m L，上层出现红色为靛基质

18、阳性反应。7.大肠杆菌测定结论：加Kovacs氏试剂，上层出现红色为靛基质阳性反应。结论：加Kovacs氏试剂，上层出现红色为靛基质阳性反应。7.4.2 MR-VP培养基:在36士1培养48士2h。以无菌操作移取培养物1mL至13mm X1 00mm试管中，加5%。一蔡酚乙醇溶液0.6 mL,40%氢氧化钾溶液0.2m L和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，观察现象。实验结论：未出现伊红色，为VP试验阴性。7.4.2 MR-VP培养基:在36士1培养48士2h。以将 M R- VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液，观察现象。 左图为滴加甲基红前。试管从做到又分别为空白管、样品管、

19、阳性管滴加甲基红后，右图将 M R- VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红Koser氏枸橼酸盐肉汤在36摄氏度培养96h.观察到到的结果是：液体澄清、无变化。实验结论：koser氏枸橼酸盐肉汤试验为阴性。Koser氏枸橼酸盐肉汤在36摄氏度培养96h.大肠杆菌鉴别结果靛基质MRVP枸橼酸盐鉴别（型别）+-典型大肠杆菌大肠杆菌鉴别结果靛基质MRVP枸橼酸盐鉴别（型别）+-典7.4. 3 革兰氏染色:取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。标准大肠杆菌大肠杆菌与金黄色葡萄球菌7.4. 3 革兰氏染色:取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌实验

20、二 食品安全国家标准食品微生物学检验 霉菌和酵母计数培养基原理:1.马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：马铃薯浸出粉有助于各种霉菌的生长；葡萄糖提供能源；琼脂是培养基的凝固剂。2.孟加拉红培养基（虎红培养基）：蛋白胨提供碳源和氮源；葡萄糖提供能源；磷酸二氢钾为缓冲剂；硫酸镁提供必须的微量元素；琼脂是培养基的凝固剂；氯霉素可抑制細菌的生长；孟加拉红作为选择性抑菌剂可抑制細菌的生長，并可减缓某些霉菌因生長過快而导致菌落漫延生長。实验二 食品安全国家标准食品微生物学检验 霉菌和酵最适合生长环境1、酵母菌a、酵母菌能在pH 值为3-7.5 的范围内生长，最适pH 值为pH4.5-5.0 b、最适生长温度一般在

21、2030之间 c、酵母菌在有氧和无氧的环境中都能生长，即酵母菌是兼性厌氧菌，在缺氧的情况下，酵母菌把糖分解成酒精和水。在有氧的情况下，它把糖分解成二氧化碳和水，在有氧存在时，酵母菌生长较快。d、适于在含糖量较高的物质生长最适合生长环境1、酵母菌2、霉菌a、大多数霉菌繁殖最适宜的温度为2530 b、一般而言，营养丰富的食品其霉菌生长的可能性就大，天然基质比人工培养基好。 c、最适水分活度为0.852、霉菌菌落特征：1、酵母菌：湿润，粘稠，易挑起，表面光华，比细菌的菌落大而厚 2、霉菌菌落的特征： a、形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或松或紧的形状。 b、菌落和培养基间的连接紧密，不易挑

22、取，菌落正面与反面的颜色、构造，以及边缘与中心的颜色、构造常不一致。 菌落特征：1、酵母菌：湿润，粘稠，易挑起，表面光华，比细菌的c、霉菌的菌丝有营养菌丝和气生菌丝的分化，而气生菌丝没有毛细管水，故它们的菌落必然与细菌或酵母菌的不同，较接近放线菌。 c、霉菌的菌丝有营养菌丝和气生菌丝的分化，而气生菌丝没有毛细实验流程实验流程5 操作步骤5.1 样品的稀释 所用样品：5.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品至盛有225 mL 灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225 mL 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10 的样品匀液。5.1.2

23、液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 mL 无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。5.1.3 取1 mL 1:10 稀释液注入含有9 mL 无菌水的试管中, 另换一支1 mL 无菌吸管反复吹吸,此液为1:100 稀释液。5.1.4 按5.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管。5.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液于2 个无菌平皿内。同时分别取1

24、 mL样品稀释液加入2 个无菌平皿作空白对照。5.1.6 及时将15 mL20 mL 冷却至46 的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于461恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。5 操作步骤5.2 培养待琼脂凝固后，将平板倒置，281培养5d，观察并记录。5.3 菌落计数肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colonyforming units，CFU）表示。选取菌落数在10 CFU150 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。5.2 培养

25、实验现象实验现象实验结果：用肉眼观察各个稀释度的平板，未发现可疑菌落。所以过期奶茶中菌落数N10。实验结果：用肉眼观察各个稀释度的平板，未发现可疑菌落。所以过实验结果分析 从本次实验结果可见，放置一星期奶茶的霉菌和酵母菌菌落总数小于10，可能是由于奶茶中添加了防腐剂，也可能是取样的奶茶的含糖量较低，营养物质含量低。实验结果分析 从本次实验结果可见，放置一星期奶茶的霉菌实验四 食品安全国家标准食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验培养基原理：1. 10氯化钠胰酪胨大豆肉汤：胰蛋白胨、大豆蛋白胨提供氮源、维生素和生长因子；葡萄糖提供碳源；磷酸氢二钾为缓冲剂；较高含量的氯化钠提供较高的渗透压，抑制大多

26、数非葡萄球菌的微生物；丙酮酸钠促进细菌生长。2.Baird-Parker琼脂基础：胰蛋白胨、牛肉膏浸粉和酵母膏粉提供碳氮源、维生素和生长因子；丙酮酸钠和甘氨酸刺激葡萄球菌的生长；氯化锂和亚碲酸钾抑制非葡萄球菌的微生物；含有卵磷脂酶的葡萄球菌降解卵黄使菌落产生透明圈，而脂酶作用则产生不透明的沉淀环；凝固酶阳性的葡萄球菌还能还原亚碲酸钾而产生黑色菌落；琼脂是培养基的凝固剂。 3.营养琼脂斜面：蛋白胨和牛肉粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；琼脂是培养基的凝固剂。实验四 食品安全国家标准食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌操作步骤：1 样品的稀释 所使用的样品：熟鸡蛋1.1 固体和半固体样品：称取25 g

27、样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000 r/min均质1 min2 min，制成1:10的样品匀液。1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，制成1:100 的样品匀液。1.4 按8.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。操作步骤：1 样品的稀释2 接种和培养2.1 每个稀释度的样品（液体样品可包括原液），分别吸取1 mL 样品匀液接种到10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤管，每个稀释度接种3管。2.2同时做一个空白对照组。并取一支阳性对照组。2.3将上述接种物，空白对照组及阳性管于36 下培养45h-48h.2 接种和培养实验现象实验现象 1. 样品稀释液中前3个稀释梯度梯度的试管中均有白色絮状物。2.用接种环从有细菌生长的各管中，移取1环， 分别接种Baird