农药登记毒理学急性吸入毒性试验

1、农药登记毒理学急性吸入毒性试验1范围GB/T 15670的本部分规定了急性吸入毒性试验的基本原则、方法和要求。 本部分适用于为农药登记而进行的急性吸入毒性试验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 14925实验动物环境及设施农药登记资料规定中华人民共和国农业部令第10号（2007年12月8日）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1急性吸入毒性 acute inhalation toxicity实验动物在短时间内（指24 h或24 h之内，通常采

2、用4 h）一次连续吸入较高浓度的受试物（气体、 蒸汽、气溶胶或颗粒状物）出现的健康损害效应。3.2吸入剂量inhaled dose动物单位体重所吸入受试物的量，即：（1）D二叫a（1）式中：Dih一吸入剂量，单位为毫克每千克（mg/kg）；c吸入气中受试物的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；t吸入持续时间，单位为分（min）；R呼吸频率，单位为次每分（次/min）；Tv受试动物的潮气量，单位为升每次（L/次）；a一与受试物反应性和溶解性相关的保持系数；W一体重，单位为千克（kg）。3.3半数致死浓度 median lethal concentration（LC50）在规定的时间内，经呼吸道一次

3、连续吸入受试物后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学 浓度，以单位体积空气中受试物的质量（mg/m3）来表示。3.4剂量-反应关系 dose-response relationship剂量与特定效应的发生率间的关系。3.5空气动力学直径 aerodynamic equivalent diameter, AD将不同形状和密度的气溶胶颗粒与不同直径的标准单位密度（1.0 g/cm3）球形颗粒相对比，当它们 的终端沉降速度相同时，就以该标准球形颗粒的直径表示此气溶胶颗粒的直径，并称之为该气溶胶颗粒 的空气动力学直径，其计量单位为微米3m）。3.6质量中值空气动力学直径 mass median

4、aerodynamic diameter, MMAD由空气动力学直径大小不一的颗粒组成的气溶胶样品中，小于和等于某一空气动力学直径（例如5 |im）的颗粒占气溶胶样品总质量或总重量50%时，则该气溶胶颗粒空气动力学直径即为此气溶胶样品 的质量中值空气动力学直径（5 gm）o3.7几何标准差 geometric standard deviation, GSD用以描述气溶胶颗粒粒径范围的无量纲数。几何标准差越小，含相似大小的颗粒比例越高，亦即气 溶胶颗粒的均一性越好，离散度越低。通常，将几何标准差小于或等于2的气溶胶样品称为单相分散气 溶胶。3.8可吸入颗粒直径inhalable diameter

5、能够通过研究对象的口和/或鼻吸入并沉淀在呼吸道任意部位的颗粒的空气动力学直径。通常将空 气动力学直径在10 |im以下的气溶胶颗粒物称为可吸入颗粒物。4试验目的通过短时间吸入染毒可初步了解受试物对实验动物的急性毒性特征和剂量-反应关系，为急性吸入 毒性分级、标签管理和其他有关的毒理学研究提供科学的参考资料，也能够为制定生产和应用过程中的 防护措施提供依据。5试验概述根据受试物的理化性质，选择适宜的方法，将其制备成特定浓度的气态、蒸汽态、气溶胶态或者颗 粒状物混悬态，输入至动式染毒系统；将实验动物随机分成对照及不同染毒剂量组，分别放置于染毒系 统中进行4 h的暴露，染毒结束后将实验动物移出；仔细

6、观察染毒期间及14 d内的毒性作用表现和体征、 死亡等情况，死亡动物应及时进行大体解剖；观察期终了时，处死动物做大体解剖，如发现病变组织或 器官应进行组织病理学检查。6试验方法试验准备受试物受试物应采用制备工艺稳定、符合质量标准规定的样品，注明名称、来源、批号、含量（或规格）、 保存条件及配制方法等，并附有检验报告。所用赋形剂、溶剂或其他介质等均应标明批号、规格和生产 厂家。受试物气化或气溶胶制备方法选择与准备气态受试物经流量计与空气混合成一定浓度之后，直接输入染毒柜。沸点较低易挥发的液态受试物通过空气鼓泡或适当加热促使其挥发后，再与空气混合，通入染毒柜中。高沸点不易挥发液态受试物根据受试物的

7、理化特性，可以选取喷雾方法，或者利用气溶胶发生装置，制备符合试验要求的液态 气溶胶再与一定量的空气混合输入至染毒柜中。粉状或固体受试物利用气溶胶发生装置，将受试物制备成固体气溶胶，再与一定量的空气混合，通入染毒柜中。动式吸入染毒方法采用机械通风装置，连续不断地将含有一定浓度受试物的空气均匀地送入染毒柜，换气量大约为12 次/h15次/h,维持相对稳定的染毒浓度。采用全身暴露或头/鼻部暴露方式对动物进行持续4 h的急性 吸入性染毒。染毒时，染毒柜内染毒气体的分配保持均衡，氧含量不低于9%, CO2含量不高于1%，温 度在（223）,相对湿度30%70% （特殊情况，如蒸汽态染毒除外）。如果采用动

8、物全身暴露的染 毒方式，为确保染毒柜内空气稳定，应当注意使实验动物的总体积不超过染毒柜体积的5%。染毒柜内 应维持微弱的负压，以防受试物泄漏污染周围环境。同时，应注意防止受试物爆炸。染毒系统可靠性的确定吸入毒性试验中，应产生稳定浓度的气态、蒸汽态或气溶胶状态的受试物。其浓度应通过间断（至 少每30 min采样一次）或连续采样，并通过适当的分析仪器，采用可靠的检测方法进行监控。对于以气溶胶染毒方式进行的吸入毒性试验，除了分析染毒柜中的浓度之外，还应测定气溶胶颗粒 的大小及其分散度。在对染毒柜浓度进行的动态检测过程中，如果连续两次测定的结果能够证明染毒柜内受试物的浓度 相对恒定，液态或气态农药及其

9、制剂在设定吸入浓度的10%,固态或干粉制剂制备的气溶胶在拟采用 吸入浓度20%的范围之内波动，则认为染毒系统对浓度的平衡和控制是成功的。否则，需要继续进行 调试。如果是固态或干粉制剂制备的气溶胶，还需对其粒径进行连续测定和监控。通常要求所制备气溶 胶的MMAD值在1 gm4 gm范围内，且应达到连续两次测定的MMAD值的波动范围在10%之内，GSD 在1.53.0之间。实验动物的准备实验动物首选健康8周10周大鼠，体重差异不得超过同性别平均体重的20%。选用其他动物需说明适当的 理由。应使用具有质量合格证的实验动物。饲养条件正式试验之前，动物应在试验环境中检疫、适应3 d5 d时间。实验动物饲

10、养条件应符合GB 14925的有关规定。每个浓度组的动物按性别分笼饲养，每笼动物数 量以不干扰动物个体活动及观察反应为度。动物食用常规饲料，自由饮水。数量和性别每个浓度组至少10只动物，雌雄各5只。雌性动物应为未妊娠和未经产的。吸入剂量与分组至少应设置3个不同浓度的染毒组，组间浓度距离适当，以便能够在各浓度组的实验动物中发生一 定程度的毒效应和死亡。同时，设空白和/或相应赋型剂、溶剂或其他介质对照组，所得资料应足以绘 制出浓度死亡曲线，并求出lc50直。如果受试物的毒性很低，也可以采用20只大鼠（雌、雄各半），进行单一剂量的急性吸入毒性试验。 单一急性吸入染毒浓度应为体积分数2X10-2（气体

11、受试物）、20 mg/L （液体受试物蒸汽）、5 mg/L （固 体或液体受试物气溶胶），如果因受试物理化性质所限，不能达到该浓度要求，也应以受试物所能达到 的最高浓度进行试验。受试物具有爆炸性时，应注意避免采用可能造成爆炸的浓度。试验步骤吸入染毒的实施染毒浓度的平衡与控制采用试验准备阶段的各种适宜条件，对染毒浓度、可吸入颗粒直径等进行控制。染毒动物的体重测定与染毒期间的观察试验开始前，应对每只动物的体重进行称量。动物持续吸入受试物的时间为4 h,染毒过程当中，动物通常处于禁食和禁水状态。吸入染毒期间，应注意观察受试物对呼吸系统的影响，如呼吸道刺激反应，呼吸节律的变化，以及 吸气和呼气模式的改

12、变等。试验观察和检查观察期限吸入染毒结束之后，实验动物每天至少仔细观察1次，连续14 d。但观察期也不是固定不变，可依 据毒性反应和体征的发生时间，以及恢复期的长短进行调整。如果染毒后动物出现中毒反应、死亡时间 延迟，观察期限应适当延长，最长不超过21 do观察内容详细观察并记录染毒动物的临床表现和体征，包括出现时间及其恢复时间、动物死亡时间等。观察 的内容包括：a）中枢神经系统和神经肌肉系统：体位异常、叫声异常、不安、呆滞、震颤、抽搐、麻痹、运动 失调、对外反应过敏或迟钝，异常行为如过度反复抓挠口周、梳理、转圈，甚至自残、倒退行 走等；b）植物神经系统：瞳孔扩大或缩小、流涎或流泪；c）呼吸系

13、统：鼻孔流液、鼻衄、鼻翼扇动、呼吸深缓、呼吸过速、蜂腰；d）泌尿生殖系统：会阴部污秽、有分泌物、阴道肿胀；e）皮肤和被毛：皮肤充血、紫绀、被毛蓬松或潮湿、污秽；f）眼：眼球突出、结膜充血、溢血性分泌物、角膜混浊；g）消化系统：腹泻、厌食。记录中毒体征的出现和消失时间以及动物死亡时间，特别是有死亡延迟趋势时，更应认真观察和记 录。衰弱或濒死动物应迅速隔离，人道处死并解剖检查，按中毒死亡处理。观察期间如果发现动物死亡 应及时解剖，如不能立即检查，应冷藏保存，并在24 h内进行解剖检查。体重称量应分别在染毒前、染毒后（至少每周一次）和动物处死之前称量并详细记录体重。病理学检查所有的实验动物均应进行大

14、体解剖，包括试验过程中死亡的动物以及试验结束时仍存活的动物。应 特别注意呼吸系统的任何改变，对于任何组织器官出现体积、颜色、质地等改变时，均应记录并进行组 织病理学检查。其他指标检查必要时，根据受试物的性质及所观察的毒性反应，宜增加其他敏感指标的检查。7试验结果和评价试验结果试验结果应包括以下内容：a）用表格列出试验中获得的各染毒组及对照组两种性别动物的全部原始数据，具体内容包括动物 编号、性别、染毒剂量、体重、各种体征及程度、死亡或存活情况、大体解剖及组织病理学检 查结果；b）分别统计各组及不同性别动物的数目，体征发生、死亡、存活、大体解剖及组织病理学检查的 各类病变发生的频数;计算不同组、

15、不同性别动物上述各项的发生率及不同时间的体重平均值；c）空气中受试物浓度、粒径、分散度等的测定结果；d）染毒空气的温度、相对湿度检测结果；e）用适宜的统计学方法对上述数据进行统计学分析；f）可能的情况下，计算出剂量-效应或剂量-反应关系；g）计算吸入染毒的lc50值。试验结果的评价根据各种反应在不同剂量下出现的时间、发生率、剂量-反应关系、不同种属动物及实验室的历史 背景数据、组织病理学检查的结果以及同类受试物的毒理学资料等，对受试物经呼吸道吸入染毒的毒理 学作用特点做出初步评价；根据毒性可能涉及的部位，综合大体解剖和组织病理学检查的结果，初步判 断毒性作用靶器官；如果能够得出比较明确的剂量-

16、效应、剂量-反应曲线，可以对受试物经呼吸道吸入 染毒作用的阈值做出初步评价；求出lc50值，对受试物的急性吸入毒性级别做出评价，急性吸入毒性级 别按照农药登记资料规定3.3.2.8条的相应标准判定；总结受试物的安全范围、出现毒性的严重程度 及可恢复性。急性吸入毒性试验的结果可为相关的后续毒理学试验剂量的选择提供参考，也可提示一些后续毒性 试验需要重点观察的指标。在参考或引用这些试验结果时，应注意各种数据和资料之间的有机联系。 lc50值应当被看作一个相对粗糙的毒理学指标，主要用于标识某一受试物吸入毒性效能及作为对其进行 毒性分级的依据，在引用或参考lc50值时，除了应结合受试物的毒性效应、组织

17、病理学检查等结果之外， 还应始终注意动物的种属、染毒时间的长短和计算lc50的方法等具体问题。8试验报告试验报告至少应包括以下内容：a）试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号；b）试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况；c）试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期；d）试验摘要；e）受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号（CAS号）（如已知）、代码（如有）、纯度（或 含量）、剂型、生产日期（批号）、理化性质、配制所用溶剂和方法；f）实验动物种属、品系、级别、数量、体重、性别、来源（供应商名称、实验动物质量合格证号、 实验动物生产许可证号），检疫、适应情况，实验动物饲养环境，包括温度、相对湿度、饲料、 单笼饲养或群饲