神经生物学-3 神经元和神经胶质细胞课件

1、 第三讲 神经元与神经胶质细胞 一、 神经元脊椎动物的神经细胞结构神经细胞及其组成成分数量多，没有传导功能。脑内含量比较：果蝇-25% 啮齿类-65% 人类-90% （与神经元的比例约为10：1）神经元的代谢和正常活动都起着重要作用：神经退行性疾病髓鞘化郎飞氏节形成突触形成 神经元信号转导 2.少突胶质细胞（oligodendrocyte）又称少突胶质,分布于灰质及白质内,位于神经元胞体及神经纤维的周围,其数量很多,约占全部胶质细胞的75。胞体较小,呈圆形或椭圆形,突起少,分支亦少,核呈圆形或椭圆形，染色稍深。电镜下可见少突胶质细胞的每一个突起包绕一个轴突形成髓鞘。它除形成髓鞘外,可能还有营养

2、和保护作用。 3小胶质细胞（microglia）分布于灰质及白质内,约占胶质细胞的5脑体较小,呈长椭圆形,常以胞体长轴的两端伸出两个较长突起,反复分支,其表面有小棘。胞核小,呈椭圆或三角形,染色较深。具有变形运动和吞噬功能,属于单核吞噬细胞系统的细胞也有人认为小胶质细胞是中枢神经系统中神经胶质的干细胞,能分化成其他胶质细胞。（二）周围神经系统的神经胶质细胞 1施万细胞（Schwann cell）：又称神经膜细胞（neurolemmal cell）,它包卷在神经纤维轴突的周围,形成髓鞘和神经膜。在神经纤维的再生中起诱导作用。 2卫星细胞（satellite cell）又称被囊细胞（capsula

3、r cell）,是包绕在神经节细胞周围的一层扁平形细胞,核圆形,染色较深。它具有营养和保护神经节细胞的功能。德国慕尼黑大学、亥姆霍兹慕尼黑中心组成的一个研究小组2010年5月18日宣布在脑细胞再生研究方面取得新进展：使用特殊的转录因子可使大脑皮层的星形胶质细胞转化为功能性神经细胞。这一成果将有助于老年痴呆症或中风等疾病的新疗法研究。 Postnatal cortical astroglia reprogrammed by forced expression of Neurog2 give rise to synapse-forming glutamatergic neurons.研究意义有望找

4、到用脑中现有的星形胶质细胞“更新”因伤或疾病而受损的脑细胞的方法。 这一成果将有助于老年痴呆症或中风等疾病的新疗法研究。 三、神经干细胞的研究进展1.什么是干细胞？有何特征？ 干细胞的基础知识录像：干细胞基础知识干细胞的概念 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。包括胚胎干细胞和成体干细胞： 胚胎干细胞： 全能的，具有分化为几乎全部组织和器官的能力 成年组织或器官内的干细胞：具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。 胚胎干细胞（Embryonic Stem cell, ES细胞）当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞即为ES细胞。是一种高度未分化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体

5、动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。成体干细胞成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。造血干细胞造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。在20世纪五十年代，临床上就开始应用骨髓移植（BMT）方法来治疗血液系统疾病。 2.干细胞分化如何调控的？干细胞的应用基础干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。内源性调控外源性调控 内源性调控干

6、细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化（1）细胞内蛋白对干细胞分裂的调控e.g 在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。 （2）转录因子的调控在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4是必需的。Oct4是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成

7、内层细胞团 白血病抑制因子（LIF） Tcf/Lef转录因子 外源性调控干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响 （1）分泌因子间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活. e.g TGF家族和Wnt信号通路。 （2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用 有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。e.g -Catenin (一种介导细胞粘附连接的结构成分)。 e.g 穿膜蛋白Notch及其配体Delta或Jagged也对干细胞分化有重要影响. （3）整合素（Integrin）与细胞外基质 整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的分子。整合素与其配体的相互作用为

8、干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。 e.g 1整合素干细胞的可塑性 _供体的干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。而在某些情况下干细胞的分化并不遵循这种规律。 e.g 1999年Goodell等人分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养5天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系。这种现象被称为干细胞的横向分化 3.干细胞来源于哪里？如何分离、培养和定向分化？干细胞的平台技术干细胞来源及其特点特征胚胎及胚胎组织干细胞脐带及脐带血干细胞骨髓及外周组织干细胞（血液，体细胞）来源及获取自然及人工流产分娩取得骨髓穿刺，外周血细胞因子激发组织学特

9、征三胚层及其选择外胚层为主单纯抗原性低，最原始较低较高增殖能力最强强较强及较低 分化全能 可生畸胎瘤多能 安全多能 安全 人类尸体大脑内里的细胞培养出多功能干细胞 现在科学家们已经从人类尸体的头皮和大脑内里收集到这样的细胞并且把它们再次转变成干细胞。换句话说，死人能够产生活体细胞，而且能够被转化成为身体中的任何细胞或者组织。研究人员称，这项研究能够带来新奇的干细胞疗法并且清楚的了解各种各样的精神障碍，比如说精神分裂症、孤独症和躁郁症，这些疾病或许就是源自于发育问题。 健康网2012-10-19无伦理道德等方面的约束；原代培养即可获取大量细胞分离成功率高，几乎可达100%；获取过程为非侵袭性操作

10、，对母体和胎儿无影响，也不会造成任何痛苦；细菌和病毒感染风险较成体组织来源的MSCs低；（6）分化潜能介于胚胎干细胞和成体干细胞之间，不会发生畸胎瘤，易于分化为3个胚层衍生的多种成熟细胞；能被诱导分化为多种神经元和各类胶质细胞，还能分泌大量的神经营养因子免疫源性低，有可能成为同种异体细胞移植的来源；转染效率高，能稳定表达外源性基因，可作为基因治疗的载体。人脐带和脂肪来源的MSCs优点来源：人脂肪组织（手术获取，均征得患者同意）、 骨髓组织（病人本身或志愿者捐赠） 足月胎儿脐带（均征得孕妇同意）干性标志性抗原表达检测：间质细胞的标志物CD29、CD44、CD90、CD105、CD166等造血干细

11、胞标志物CD34、CD45、CD14等技术路线脂肪、骨髓间充质干细胞原代培养干细胞特性鉴定细胞活力测定神经向诱导分化化学诱导方法鼠脑条件培养基诱导方法成神经球后分化诱导方法形态学检测免疫荧光检测神经特异性标记 -Tubulin NSE Nissl突触形成检测神经细胞分泌功能检测肝样诱导分化共聚焦显微镜及免疫蛋白印迹检测不同分化阶段细胞几种特异蛋白的表达图1-1 脂肪间充质干细胞（AMSCs）形态学观察 AMSCs形态学观察图1-2 骨髓间充质干细胞（BMSCs）形态学观察BMSCs形态学观察图1-3 第5代MSCs细胞表面抗原MSCs表面抗原鉴定图1-4 AMSCs向成骨细胞分化MSCs成骨细

12、胞诱导分化钙钴法染色图1-4 MSCs向成脂细胞分化 MSCs成脂细胞诱导分化油红染色图1-6 MSCs生长曲线及冻存复苏后细胞生长曲线MSCs增殖能力比较化学方法诱导后形态学鉴定图2-1 化学因子诱导后类神经元形态 A：诱导14 days B：诱导30 days鼠脑条件培养基诱导后形态学鉴定图2-1 鼠脑条件培养基诱导后类神经元形态 C：诱导7days D：诱导14days 成神经球分化诱导后形态学鉴定图2-1成球诱导分化后类神经元形态 E：成球诱导72 h F：Nestin荧光染色鉴定图2-2 AMSC经过不同方法诱导后-Tubulin表达免疫荧光检测三种方法诱导后-Tubulin检测三种

13、方法诱导后NSE检测图2-3 AMSC经过不同方法诱导后NSE表达免疫荧光检测三种方法诱导后Nissl检测图2-4 AMSC经过不同方法诱导后Nissl表达免疫荧光检测图2-5 Syn及Basson Real time PCR 检测不同分化阶段基因表达突触基因Basson、Syn检测图2-5 Basson蛋白表达及定位 经成球诱导分化9 d后，检测FITC标记Basson免疫荧光表达，Hoechst33258染核突触蛋白Basson检测图2-6 Elisa法检测诱导后AMSCs的EGF，BDNF因子分泌功能（* P0.05）诱导后类神经元细胞分泌功能检测图3-1 共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓

14、度。成神经分化后细胞内游离Ca2+浓度的变化图3-2 不同诱导天数细胞内钙离子流变化趋势。取未分化AMSCs及成球诱导法诱导的分化不同天数（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d）的类神经元细胞经10 umol/LFluo3/AM染色30min后，经共聚焦显微镜扫描拍摄单个细胞内的荧光强度值。（n=10）成神经分化后细胞内游离Ca2+浓度的变化Fig 3 ER-a36, a isoforms of ERa, is highly expressed throughout in human mesenchymal stem cells (hBMSCs )Fig 4 ER-a36 is

15、translocated into nucleus related with Runx2 in osteogenetic differentiation of BMSCs cells 4.当前干细胞研究的热点问题？-干细胞的研究进展 录像：干细胞的研究进展应用干细胞治疗疾病: e.g 组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死， 退行性病变如帕金森综合征, 自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。低毒性（或无毒性），一次药有效； 不需要完全了解疾病发病的确切机理； 还可能应用自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。用干细胞治疗疾病已不再只是设想。 5.干细胞临床应用和展望-干细胞移植和干细胞产业 录像：干

16、细胞产业自2009年美国总统奥巴马签署命令解除对胚胎干细胞研究的政府资金支持限制后，美国联邦食品药品监督局（FDA）放行干细胞临床实验和干细胞产品。2010年批准了第一个上市的干细胞治疗药物-美国杰龙公司的一个干细胞药物。短短几年的时间，美国、欧盟、日本、韩国和中国在干细胞领域发展迅速，不但投入重金支持基础和临床研究，还大力推动干细胞产业化发展。全国12家造血干细胞移植中心。我国目前公共脐血库保存超过3万份，脐血移植病例近600例。全球主要国家已建立100余家公共脐血库和超过300家的自体脐带血库，保存无关供者脐带血干细胞超过30万份，自体储存脐带血超过150万份，脐血移植病例已超过1万例，并

17、且正在以每年超过2000例的速度增加。 人类尸体大脑内里的细胞培养出多功能干细胞 现在科学家们已经从人类尸体的头皮和大脑内里收集到这样的细胞并且把它们再次转变成干细胞。换句话说，死人能够产生活体细胞，而且能够被转化成为身体中的任何细胞或者组织。研究人员称，这项研究能够带来新奇的干细胞疗法并且清楚的了解各种各样的精神障碍，比如说精神分裂症、孤独症和躁郁症，这些疾病或许就是源自于发育问题。 健康网2012-10-19深圳的北科公司是中国最大的干细胞疗法中心，他们和超过20家内地医院合作开展“细胞康复门诊”，在印度、日本、巴拿马等国也有合作的医疗机构。北科董事长胡祥接受南都采访时表示，他们迄今已经治疗了6000多位患者，包括40多个国家的500多名外国人。加利福尼亚州福斯特城的吉利德（Gilead）生物技术公司即将获得相关部门对其慢性丙型肝炎病毒感染治疗药物的批准；总部位于纽约的百时美施贵宝（Bristol-Myers Squibb）公司研发出了以免疫系统为靶标的肿瘤治疗药物，引起了巨大的轰动（Nature 496, 14-15；2013）。由124个生物技术类股组成的纳斯达克生物技术指数（NASDAQ Bi