腺病毒使用操作手册吉满生物版本

1、 版本号：20141208腺病毒使用操作手册目录 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc405800906 1. 腺病毒安全使用规范 PAGEREF _Toc405800906 h 2 HYPERLINK l _Toc405800907 2. 腺病毒的储存与稀释 PAGEREF _Toc405800907 h 2 HYPERLINK l _Toc405800908 3. 腺病毒体外感染实验 PAGEREF _Toc405800908 h 2 HYPERLINK l _Toc405800909 3.1 感染和分析 PAGEREF _Toc405800909 h 2 HY

2、PERLINK l _Toc405800910 3.2腺病毒感染靶细胞预实验 PAGEREF _Toc405800910 h 3 HYPERLINK l _Toc405800911 3.3腺病毒感染靶细胞正式实验 PAGEREF _Toc405800911 h 4 HYPERLINK l _Toc405800912 4. 动物实验 PAGEREF _Toc405800912 h 41. 腺病毒安全使用规范1.1 吉满生物采用最新的AdMAX系统，病毒生产更快捷，病毒滴度高，并且具有很高的生物安全性。1.2 病毒操作时最好使用生物安全柜，如使用普通超净工作台操作病毒，务必不要打开风机。1.3 病

3、毒操作时必须穿实验服，带口罩和手套。1.4 操作病毒时必须特别小心，不要产生气雾或飞溅。如果操作时生物安全柜有病毒污染，立即用10%次氯酸钠溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液于10%次氯酸钠溶液内浸泡1h以上后弃去。1.5 用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板。用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前，用70%乙醇清理显微镜实验台。1.6 病毒操作完毕后，脱掉手套，用肥皂和水清洗双手。2. 腺病毒的储存与稀释2.1 病毒的储存：客户在收到腺病毒液后，如果在很短的时间内就开展实验的话，可以将病毒置于4保存（一周内用完）；

4、如果长期保存可将病毒置于-80冰箱。2.2 反复冻融对病毒的滴度是有影响的，所以尽量避免反复冻融，建议分装成小体积的方便每次使用。2.3 病毒的稀释：客户如需稀释病毒，可以先将病毒冰浴融化，再用完全培养基（培养目的细胞用）稀释混匀后4保存，为保证病毒滴度，建议在3天内使用完毕。3. 腺病毒体外感染实验3.1 感染和分析腺病毒颗粒对不同的组织和细胞亲嗜性不同，因此在使用腺病毒颗粒之前查阅相关文献，了解Adenovirus对靶细胞的亲嗜性、感染复数（MOI值）及体内注射所需的病毒量，如无相应的文献支持，则需要预实验检测病毒对靶细胞的亲嗜性以及和合适的感染复数（MOI值）。腺病毒感染细胞时，尽量减少

5、原培养器皿中的培养基，小体积感染2h后吸去含病毒的培养液，换上新鲜培养液37培养24-36h，检测病毒感染情况。3.2腺病毒感染靶细胞预实验3.2.1腺病毒感染目的细胞预实验注意事项 测定腺病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对腺病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。 在进行腺病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响腺病毒的感染效率。 一般腺病毒单位为pfu/ml，是噬斑形成单位，指每毫升病毒液中所含有的具有侵染性的腺病毒颗粒。3.2.2 腺病毒感染细胞的合适MOI值的确定若无相关文献支

6、持，需要通过预实验确定合适的感染复数（MOI值）。MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。我们建议通过比较不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），选择适合的MOI进行实验，在确定MOI值时，可以首先选用携带报告基因的病毒（如：带GFP或RFP）。以96孔培养板为例，进行目的细胞和对照组细胞的感染预实验，实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量。第一天，目的细胞和平行对照组细胞（对腺病毒亲嗜性较高的细胞如293T，Hela）以5103个/孔接种于96孔板中，接种细胞数因细胞的生长速度而略有

7、不同，每孔培养基的体积为100l，细胞数以第2天密度约50-70%为宜，37 培养过夜。第二天，感染前，从-80冰箱取出腺病毒后在冰浴融化病毒，进行 10倍稀释液，100倍稀释液，1000倍稀释，可以根据实际实验需要设计更多的MOI值梯度。吸去培养器皿中的培养基90l，在目的细胞和对照细胞中分别加入不同MOI值的病毒液90l。混匀后放于二氧化碳培养箱（37、5%CO2）孵育2h，换新鲜的培养基培养24-36h后检测。注：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果影响很大，所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态。第三天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计腺病毒感染目的细胞的效率，最后确

8、定合适的MOI值。腺病毒感染靶细胞正式实验3.3.1贴壁细胞腺病毒感染第一天按实验需要将细胞铺板（比如24孔板）。细胞数以第2天密度约50-70%为宜。37 培养过夜。第二天感染前，从-80冰箱取出后在冰浴融化病毒，参考相关文献或者根据预实验得到的MOI值用新鲜完全培养基将病毒稀释成所需浓度。注意：轻轻混匀，不要使用振荡器。 吸去细胞原有培养基，加入原来培养液1/2体积的新鲜完全培养基，然后将按照MOI稀释好的病毒液加入细胞中。混匀后放入培养箱37感染2h。2h后吸去含病毒的培养液，换上新鲜培养液37培养24-36h。荧光显微镜观察病毒感染情况3.3.2悬浮细胞腺病毒感染 悬浮或半悬浮细胞，需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后，低速离心1h，然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置10min（不能超过半小时），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染至2小时后换液即可。4. 动物实验4.1