新一代测序技术的引入-ThermoFisherScientific课件

1、新一代测序技术在疑难案件中的应用新一代测序技术在疑难案件中的应用CE法庭DNA检测技术金标准三十年的法庭科学DNA技术发展过程中,CE技术屡立奇功,目前大多数案件能够用CE+STR的方法解决数据可靠、工作简单、快速、经济、数据库系统DNA扩增片段长度多态性人类重复序列DNA探针复合扩增STR位点的DNA分型新一代技术的融入？CE法庭DNA检测技术金标准三十年的法庭科学DNA技术发展DNA检验技术1985年才开始运用于法庭科学检验鉴定中，但由于可以到达个人认定的作用发展迅速。20多年的发展，DNA从DNA指纹图发展到STR检验。DNA实验室检验灵敏度得到了提高，可以检测到ng(106g )级ST

2、Rs英国第一起移民纠纷案的DNA指纹图高降解识别率高识别率能自动分型结果数字化快速分型检验时间缩短基于PCR方法微量DNA等位基因不连锁费用较贵信息量大DNA检验技术1985年才开始运用于法庭科学检验鉴定中，但主要有以下几方面的作用1、同一认定：除同卵双生的双胞胎、骨髓移植的患者外，两个人基因分型相同的概率只有100亿分之一（1010）。主要有以下几方面的作用1、同一认定：除同卵双生的双胞胎、骨髓2、亲缘认定（遗传关系）2、亲缘认定（遗传关系）母系遗传 （mtDNA）母系遗传 （mtDNA）父系遗传（Y染色体）?uncle3rd cousinThomas Jefferson IIField J

3、effersonPeter JeffersonPresident Thomas JeffersonEston HemingsThomas WoodsonDifferent Y HaplotypeSame Y HaplotypeJefferson Y HaplotypeJefferson Y Haplotype?父系遗传（Y染色体）?uncle3rd cousinThom3、现场重建3、现场重建1of6 样本高度降解，仅能得到部分、甚至得不到STR图谱 复杂混合样本解释 复杂亲缘关系鉴定 未知来源的组织、体液溯源 表型推断 始祖推断 当前法医DNA实验室的挑战更高的要求，更多的挑战1of6 样本

4、高度降解，仅能得到部分、甚至得不到STR图谱当疑难案件的检测有待新技术的融入10混合检测降解/痕量检材数据库无记录疑难复杂家系但CE本身技术上的局限性,无法在一些疑难案件上取得实质性的突破,领域中需要有新技术的融入疑难案件的检测有待新技术的融入10混合检测降解/痕量检材数据新一代测序技术的引入新一代测序技术(Next Generation Sequencing)也称高通量测序 同时能测几千到几百万的DNA片段，后续通过组装和对比完成。 下一代测序平台能测到200-400bp，甚至更长。 高通量；全基因组；高覆盖度新一代测序技术的引入新一代测序技术(Next Generat广东省厅NGS平台一览

5、1of6广东省厅NGS平台一览1of6124 SNP位点（含90个常染色体位点和34个Y染色体位点）Pi ranges from 1x10-31 6x10-35扩增长度短(平均132, 141nts,) 适合降解 DNA推荐1ng 起始DNA对于 43 Ken Kidd SNPs， 有99.99% 的一致性微量、高度降解检材,复杂亲缘关系辅助鉴定HID-Ion AmpliSeq 身份鉴定试剂盒124 SNP位点（含90个常染色体位点和34个Y染色体位点Coverage% PositiveGenotypeMajor Allele每个SNP位点信息样本间的比对Y 单倍型预测HID-Ion Ampl

6、iSeq 身份鉴定试剂盒Coverage% PositiveGenotypeMajo 因祖坟迁移事件，80余岁的事主无法确定祖坟内究竟是否是自己的祖坟。故需要做相关亲缘鉴定。但由于严重降解, 毛细管电泳技术无法得到有效的分型。故通过二代测序技术进行进一步的检测 NGS案例应用(1):高度降解检材检材状况：案件背景检材状况 因祖坟迁移事件，80余岁的事主无法确定祖坟 NGS案例应用(1):高度降解检材牙齿检材:参照血卡:牙齿检材已经严重降解,无法得到有效分型,并进行下一步的鉴定 NGS案例应用(1):高度降解检材牙齿检材:参照血卡:牙齿 NGS案例应用(1):高度降解检材NGS结果展示: NGS

7、案例应用(1):高度降解检材NGS结果展示:利用ID panel进行个体识别身份验证： 牙齿检材 对照检材符合孟德尔规律位点不符合孟德尔规律的位点常染色体位点79906811Y染色体位点 24 3423 1全部位点103 1249112NGS测序结果显示，90个常染色SNP位点中，双方均出齐的位点为79个，其中有11个位点不符合孟德尔遗传规律。且Y位点有一个位点不一致，故排除坟墓中的故人是事主的生父 NGS案例应用(1):高度降解检材利用ID panel进行个体识别身份验证： 牙齿检材 最终信息常染色体位点Y染色体位点共出位点无名尸结果741993 因无相关数据库和对照样本，所以无法进行相关比

8、对。但是可建议放入宗卷，以便将来数据库或其他参照样本可以进行对比利用ID panel进行个体识别身份验证：CE结果显示无名尸骨高度降解： NGS案例应用(2):高度降解无名尸 最终信息常染色体位点Y染色体位点共出位点无名尸结果7鉴定莫XX和莫XX的丈夫是否为孩子A和孩子B的亲身父母。莫XX为骨髓移植患者，且移植已多年，效果不错，考虑其血液可能表现为供体基因分型，遂要求采其口腔拭子、血拭子、指甲和头发；要求提供骨髓移植供体的血拭子；其丈夫、孩子A、孩子B的口腔拭子共8份检材，使用Identity SNP Panel 在PGM平台上检测。同时使用Global Filer试剂盒结果作为参照. NGS

9、案例应用(3):移植患者亲子鉴定鉴定莫XX和莫XX的丈夫是否为孩子A和孩子B的亲身父母。 N莫XX、莫XX丈夫、两个孩子的SNP分型符合孟德尔遗传；该结果与使用Global Filer做出来的结果完全一致。莫XX血液与骨髓供体的SNP分型完全一致；与自身头发分型不一致。莫XX头发、指甲的SNP分型完全一致；Samples莫-口腔莫丈夫-口腔孩子B-口腔莫-血骨髓供体-血孩子A-口腔莫-头发莫-指甲莫-口腔67798888819191莫丈夫-口腔67686565686262孩子B-口腔79687373868282莫-血886573100767979骨髓供体-血886573100767979孩子A

10、-口腔81688676768282莫-头发916282797982100莫-指甲916282797982100 NGS案例应用(3):移植患者亲子鉴定莫XX、莫XX丈夫、两个孩子的SNP分型符合孟德尔遗传；该结Bone, teeth, and hair are the typical biological sources left from missing persons or remains失踪人员/无名尸体常见生物性检材：骨头、牙齿、头发Ion AmpliSeq technology can streamline the mtGenome sequencing workflowIon Am

11、pliSeq 技术科简化线粒体基因组测序流程线粒体全基因组/高变区测序试剂盒Average amplicon length is 163ntAverage amplicon overlap of 11ntIon AmpliSeq mtGenome Panels线粒体全基因组测序Bone, teeth, and hair are the 打拐工作开展过程中怀疑安徽省的沈某（现年43岁）是山西省的连某（现年59岁，疑似姐姐） 家中走失亲人。由于年事已高，双亲皆故。所以需要进行疑似亲姐妹全同胞/半同胞鉴定。解决思路： 若直接采取传统CE对全同胞进行检测需要检测进行至少超过39个STR位点，在根据IB

12、S评分来进行断定，若IBS评分为42分以上，准确率在百分之九十五以上。但其是建立在全同胞的基础，结合打拐案情，可直接对两者的线粒体进行测序，判断是否来自同一母系。 NGS案例应用(4):疑似亲姐妹打拐鉴定案件背景常规思路 NGS案例应用(4):疑似亲姐妹打拐鉴定案件背景常规思路线粒体二代测序结果展示软件分析的参考序列参考序列序列在该位点上的分型测试样本在该位点上的分型线粒体二代测序结果展示软件分析的参考序列参考序列序列在该位点连某沈某一致位点不一致位点线粒体全基因组25271326高变区24424高变区14618通过线粒体全基因组测序，排除连某与沈某是来自于同一母系连某沈某一致位点不一致位点线

13、粒体全基因组25271326高变： 若直接采取传统CE对全同胞进行检测需要检测进行至少超过39个STR位点，在根据IBS评分来进行断定，若IBS评分为42分以上，准确率在百分之九十五以上。但其是建立在全同胞的基础，结合打拐案情，可直接对两者的线粒体进行测序，判断是否来自同一母系。 NGS案例应用(5):疑似亲姐妹打拐鉴定案件背景常规思路： NGS案例应用(5):疑似亲姐妹打拐鉴定案件背景常规思路疑似妹妹疑似姐姐一致位点不一致位点线粒体全基因组4848471高变区25550高变区14440通过线粒体全基因组测序，不排除两份受检者来自于同一母系PS: 不一致位点为疑似姐姐在非高变区存在一个点异质性

14、变异疑似妹妹疑似姐姐一致位点不一致位点线粒体全基因组484847没有嫌疑人，DNA数据库未比中始祖推断或者表型推断，如眼睛颜色、头发颜色和皮肤颜色，可以给案件侦查提供更多线索HID-Ion AmpliSeq 祖先推断试剂盒扩增子长度短 (平均长度122;130 nt) 推荐1ng 起始DNA55 Ken Kidd SNPs，99.77% 的一致性165 常染色体SNP没有嫌疑人，DNA数据库未比中HID-Ion AmpliSe版式设计版式设计165 常染色体SNP适合案件检材或者降解DNA扩增片段短(平均122;130 nt) 推荐1ng 起始DNA对于55个 Ken Kidd SNP，有99

15、.77% 一致性HID-Ion AmpliSeq始祖推断试剂盒版式设计版式设计HID-Ion AmpliSeq始祖推断试对实验室积累种族样本,包括5个封闭的满族家系和5个封闭的新疆家系进行始祖定位始祖认定二代测序结果展示对实验室积累种族样本,包括5个封闭的满族家系和5个封闭的新疆5组封闭满族种族定位：尽管都能定位到Han-HapMap,但是无法在地域上进一步细分 NGS案例应用(6):满族及维族始祖认定5组封闭满族种族定位：尽管都能定位到Han-HapMap,但五组新疆建库样本种族定位：基本能够定位在和维族遗传很近的民族(Hazara),在地域定位比较一致准确 NGS案例应用(6):满族及维族

16、始祖认定五组新疆建库样本种族定位：基本能够定位在和维族遗传很近的民族NGS-STR用于CE辅助的优势更加适合降解检材：容纳更多的mini-STR获得更多的信息：同一分型不同序列NGS-STR用于CE辅助的优势更加适合降解检材：容纳更多的NGS-STR用于CE辅助的优势可以给予更多信息9947A ，NGS- D8S1179基因分形结果基因分型的结果类似于CE的展示结果同一基因型不同分型的结果NGS-STR用于CE辅助的优势可以给予更多信息9947ACE-STR复杂家系NGS-STR验证(1)将十余对CE-STR复杂家系用STR-panel进行验证：一致案例父亲分型：11,13母亲分型：8，98，12子代分型：CE-STR复杂家系NGS-STR验证(1)将十余对CE-CE-STR复杂家系NGS-STR验证(2)4, 1413, 13 4, 13父亲NGS分型：母亲NGS分型：子代NGS分型：家系背景 通过CE结果显示父亲在D19S433的分型为14,14.目前在D19S433的分型为13,13.小孩的分型为13,13.初步判定为时一个一步突变的家系.故用新一代测序平台进行STR分型验证.CE结果与二代测序不符,且二代测序结果符合孟德尔遗传定律CE-STR复杂家系NGS-STR验证(2)4, 1413CE-STR复杂家系