一氧化氮合成酶和心钠素在豚鼠耳蜗的分布

1、一氧化氮合成酶和心钠素在豚鼠耳蜗的分布【关键词】心钠素;,一氧化氮合成酶;,免疫荧光双标染色摘要目的:观察豚鼠耳蜗部分心钠素ANP和一氧化氮合成酶NS免疫组化反响产物的分布及其互相关系,为研究ANP和NS在豚鼠耳蜗部分血流、淋巴以及神经调节中的互相作用提供形态学研究的根据。方法:采用免疫荧光组织化学双标法观察ANP和NS在正常豚鼠耳蜗的分布特征。结果:在耳蜗各转螺旋动脉和血管纹均发现ANP和NS双阳性表达,螺旋缘、螺旋韧带和rti器,耳蜗神经节细胞有ANP和NS双阳性染色。结论:ANP和NS的分布特点显示,二者在内耳血流调节,内、外淋巴平衡调节以及神经信号传递等方面可能存在亲密的互相作用。关键

2、词心钠素;一氧化氮合成酶;免疫荧光双标染色对一氧化氮nitrixide,N的研究说明,其作为一种强有力的血管扩张因子,存在于豚鼠耳蜗血管内皮、神经节细胞及毛细胞中,通过直接激活ATP敏感的钾离子KATP通道使豚鼠蜗轴螺旋动脉spiraldilarartery,SA的内皮及平滑肌细胞浓度依赖性地去极化,引起血管扩张1。N合成的关键酶一氧化氮合成酶nitrixidesynthase,NS主要分布于内外毛细胞、蜗神经节细胞及耳蜗血管纹1。心钠素atrialnatriuretipeptide,ANP也具有强大的扩张血管、增加组织血流量及调节部分组织水电解质平衡等作用。ANP在内耳分布于螺旋韧带、rti

3、器、螺旋神经节、血管纹及SA等处,参与调节耳蜗血流与内耳微循环平衡状态2。本实验我们采用免疫荧光双标的方法研究N与ANP在内耳构造中的分布特点,讨论N与ANP对耳蜗部分环境的影响及其互相间作用。1材料和方法1.1材料安康红目白色豚鼠,雌雄不限,体质量250350g,购自第四军医大学实验动物中心。兔抗大鼠uNS多克隆抗体为labvisin公司产品,小鼠抗人ANP单克隆抗体Ab为hein公司产品,购于晶美生物工程。y3标记羊抗兔IgG为Siga公司产品,FIT标记山羊抗小鼠IgG为中杉金桥公司产品,购于武汉博士德生物公司。1.2方法1.2.1组织标本制备豚鼠5只,戊巴比妥钠60g/kg,腹腔注射麻

4、醉后开胸,经升主动脉灌注生理盐水300L冲出血液,用40g/L多聚甲醛500L4灌注固定1h。取双侧耳蜗,刺破圆窗膜,置于上述固定液中过夜;后置于100g/LEDTA25脱钙714d,移入250g/L蔗糖缓冲液46h后,用T包埋,平行蜗轴10进展连续冰冻切片备用。1.2.2免疫荧光染色冰冻切片滴加1500稀释兔抗大鼠uNS多克隆抗体,4孵育24h;甩去玻片多余液体,直接添加1500稀释小鼠抗人ANPAb,4孵育24h。001l/LPBSpH74洗3次,避光同时添加二抗稀释度均为1100,37孵育30in后,避光条件下001l/LPBS洗3次,共聚焦显微镜下观察并拍照。2结果镜下可见,在耳蜗各转

5、的血管纹均有ANP和NS分布图1。耳蜗各转螺旋韧带可见ANP和NS较多分布图1。在窝轴螺旋动脉,主要分布在血管内膜图1、2。耳蜗各转rti器中毛细胞及支持细胞可见二者分布图1。另外,螺旋缘沟状垫亦可见二者分布图1、2。前庭膜及盖膜均无分布图1。可见耳蜗各转神经节细胞及其相应神经纤维束分布量较多,有少数单纯绿色荧光为主的神经细胞图2。3讨论有研究认为,N主要通过上调第2信使GP的表达,使平滑肌细胞内平滑肌纤维舒张,从而扩张SA3。ANP主要通过与ANP受体相结合后催化胞膜型鸟甘酸环化酶G产生大量GP,从而影响离子通道、蛋白激酶等,发挥相应信号调节功能4。Rahel等5研究发现ANP可增加前庭的血

6、流量,并有剂量依赖性,同时ANP的舒张血管作用也依赖于GP。血管纹ANP和NS的大量分布,提示ANP和N可能在此处发挥对部分血流量及蜗管中内淋巴液平衡的调控作用。螺旋韧带ANP和NS共同分布,说明ANP和N可能作用于螺旋韧带引起部分微构造变化,而参与部分体液平衡及内淋巴的调节过程。在rti器中的rti淋巴与外淋巴成份相似,因支持细胞间的严密连接而与内淋巴分隔。图1ANP和NS在耳蜗的分布间接免疫荧光染色,200略A:y3标记NS分布,B:FIT标记ANP分布,:y3、FIT双标记红色荧光示NS分布,绿色荧光示ANP分布,黄色荧光为二者共表达.图2ANP和NS在螺旋神经节的分布(间接免疫荧光染色

7、,200略A:y3标记NS分布,B:FIT标记ANP分布,:y3、FIT双标记红色荧光示NS分布,绿色荧光示ANP分布,黄色荧光为二者共表达.本实验中我们观察到在支持细胞和螺旋缘均可见NS和ANP分布,此结果显示N和ANP可能通过调节支持细胞膜电位,或通过改变细胞骨架形态而影响细胞间隙进而影响内淋巴的代谢3,5。Sabrane等6认为,ANP通过引起内皮释放N而发挥血管扩张作用。adhani等7研究发现:大动脉和肠系膜小动脉ANPGP通路受NGP程度调节,同时内皮源性N的释放受部分ANP浓度的影响。可以说,ANP是通过其特有的方式影响N的合成和释放,并通过N的介质作用,至少部分通过N作用,参与

8、血管舒张,排钠利尿等调节作用。但ANP和N在耳蜗血流调节和内淋巴生成调节中的互相作用机制尚不明确,仍需进一步研究。已有研究证实N作为一种非经典神经递质发挥着信息传递等作用3。ANP是多肽类信号分子,也发如今中枢神经广泛分布,提示其在神经信号传递中可能有一定的作用。对谷氨酸glutaiaid,Glu的研究认为,Glu主要从突触前膜释放,引起突触后膜去极化、a2+内流,从而激活NS,催化产生N;N再与胞内型G结合,上调GP程度,进而发挥信号传递的作用8。N与ANP都会引起胞质内GP及a2+浓度的改变9,从而影响ATP敏感的K+通道,改变细胞膜电位程度,提示其二者可能参与毛细胞兴奋性的调控,参与Gl

9、u介导的听觉神经传入等过程。蜗神经节细胞和轴突可见NS分布,说明N在听觉传递中有重要作用。同时实验观察到在蜗神经节细胞ANP大量分布,提示ANP可能在神经细胞水电解质平衡或者信号传递中也有重要作用。实验中存在ANP阳性表达为主的神经细胞,高度提示ANP在神经传递过程中具有独特的作用。因此,神经节细胞中的ANP是否由神经细胞自己生成,ANP在神经细胞中是否存在重要功能仍需进一步研究。总之,NS和ANP在耳蜗组织中分布广泛,且分布位置相似,提示二者在耳蜗部分血流调节、淋巴液平衡、微环境调节以及神经信号传导中有较为重要的作用,但对于它们之间潜在的互相影响机制目前尚不明确,仍需进一步的研究。参考文献:

10、1李学昌.一氧化氮、一氧化氮合酶及其与内耳的关系J.国外医学耳鼻咽喉科学分册,2000,24(3):160-164.2陈合新,史剑波,邱建华,等.心钠素免疫反响在豚鼠耳蜗中的整体分布J.中国临床解剖学杂志,2002,20(4):290-291.3SiJQ,ZhaH,YangYQ,etal.NitrixideindueshyperplarizatinbypeningATPsensitiveKhannelsinguineapigspiraldilararteryJ.HearRes,2002,171:167-176.4GargR,PandeyKN.Regulatinfguanylylylase/na

11、triuretipeptidereeptrAgeneexpressinJ.Peptides,2022,26(6):1009-1023.5RahelJD,DziadzilaJK,QuirkS.AtrialnatriuretipeptidepartiipatesintheregulatinfvestibularbldflJ.HearRes,1995,89(1-2):181-186.6SabraneK,GabaryanS,BrandesRP,etal.Inreasedsensitivitytendthelialnitrixide(N)ntributestarterialnrtensininieithvasularsthusleseletivedeletinftheatrialnatriuretipeptide(ANP)reeptrJ.JBilhe,2022,278(20):17963-17968.7adhani,StlandRS,aAllisterRJ,etal.VasularnatriuretipeptidereeptrlinkedpartiulateguanylateylasesaredulatedbynitrixideyliGPsignal