红叶石楠耐铅内生细菌的分离及其16SrDNA鉴定

1、红叶石楠耐铅内生细菌的分离及其16S rDNA鉴定）要：通过生理分析和分子鉴定相结合的方法,对种植于公路两旁的红叶石楠根茎叶不同部分的内生菌进行分 离纯化。结果表明，从不同组织中初步分离出内生细菌44株，均为革兰氏阳性菌，对这些菌株做生理生化鉴定；提取 生理生化结果有差异的细菌DNA并扩增其16S rDNA序列，通过BLAST比对分析并利用MEGA软件建立发育树 等分子鉴定手段初步推断，这些内生细菌在亲缘关系上与不动杆菌属、假单胞菌属和蜡样芽；杆菌最为接近。本研究 为铅污染地区土壤的微生物与植物联合的生物修复提供了行之有效的技术理论基础。关键词：红叶石楠；铅；内生细菌;植物修复Isolatio

2、n and 16S rDNA Identification of Pb-resistant EndophyticBacteria Isolated from Photinia serrulataAbstract: The method of identifying the physiological analysis and molecular identification were involved in this study. Then isolation and purification of endophytic Bacteria from different parts of Pho

3、tinia serrulata were carried out. The results showed that 44 strains endophytic bacteria isolated and purified were all Gram-positive bacteria, and 44 strains endophytic bacteria were identified physiologically and biochemically. DNA was extracted from bacteria, 16S rDNA sequence by PCR, blast analy

4、sis, phylogenetic tree using establishing by MEGA software. It was inferred that in terms of kinship, these endophytic bacteria had a close relation with Pseudomonas, Bacillus cereus and Acinetobacter. This study provided an effective technical basis for microbial-plant combined bioremediation techn

5、ology in lead contaminated areas.Key words: Photinia serrulata, lead; endophytic bacteria; phytoremediation我国作为一个矿产资源相对丰富的国家，矿产资源大量利用促进了国民经济的快速发展，同时 因矿产资源的开发利用而产生了生态环境问题&重金属污染具有隐蔽性和高额治理成本等特点，特 别是对土壤的污染具有不可逆的作用，并通过植物和作物产品转接到人类的食物链环节,由此引起 重金属对人类的毒害&从2018年福建省环保厅下发文件福建省涉重金属行业污染防控工作方案 中提及，在所有福建省的重点污染物中，铅

6、位居5种重金属污染之首。在修复重金属污染土壤的技 术中,化学、物理和生物修复这三种方法最为有效，前两者或存在产生二次污染,或者费用高等缺 点，生物修复技术则避开了上述两种修复方法的缺点，特别是微生物和植物联合修复重金属污染土 壤，这种方法克服了受铅胁迫的植物生长缓慢以及吸附的重金属难以从土壤中除去等缺点，其修复 效果逐步受到科学工作者的认可7。红叶石楠(Photinia serrulata )是福建地区常见的小乔木或灌木，新梢和新叶为鲜红色，且不受环 境中铅离子的毒害，目前作为公路街道路旁的行道树而大量种植但由于红叶石楠生物量较小，不 适合于矿山等大面积铅污染的修复，因此从耐铅的植物上分离纯化

7、出耐铅的内生细菌，并接种到乔 木上，从而选育出适合矿山种植的树种，以达到修复矿山等大面积铅污染土壤的目的。关于耐铅的内生细菌的研究鲜有报道，仅本课题组从小飞蓬(Conyza canadensis)和龙葵(Solanum nigrum)等草本植物上成功分离出耐铅的内生细菌5$可，但由于草本植物多为一年本植物，且没有木 本植物的高大树干，因此，无法确定分离出来的内生细菌能否成功殖在木本植物。有研究表明，内 生细菌与宿主植物组织表面的亲和机制如何,可能会影响到内生细菌侵染宿主植物的效率，并可 能是影响内生细菌共生特异性的因素。还有研究表明，许多的植物内生细菌具有宿主专一性特 点，同一植物不同品种因环

8、境或其他原因，也具有不同种类的内生细菌，同种内生细菌定殖寄主 体内和促进寄主的生长的能力，也可能因同种植物不同的品种而有所差异闫。基于此，本研究期望 从耐铅的小乔木红叶石楠上分离纯化出耐铅的内生细菌，为成功定殖在木本植物体内并提高其耐 铅的能力打下基础。1材料与方法1.1材料与方法1.1.1红叶石楠取自栽种于三明学院校门G205国道两侧绿化带中红叶石楠根茎叶3个部位，由于此路段有大 量重型汽车行驶经过且车流量较大，且汽车尾气中的主要成分是含铅化合物，所以此路段土壤在受 到到汽车尾气的长期污染下已存在铅重金属污染，而栽种的植株必定受到一定程度的铅胁迫。1.1.2培养基牛肉膏蛋白5固体培养基，其中

9、铅离子浓度依次为0、0.3 #0.6、0.9、1.2 mol/mL回。1.2内生细菌的分离和纯化红叶石楠内生细菌的分离方法参照本课题组小飞蓬耐铅内生细菌的分离方法问。1.3形态及生理生化鉴定对分离纯化的菌株进行柠檬酸盐反应、VP试验、革兰氏染色、甲基红试验和接触酶反应等检验性1.4分子鉴定菌株基因组DNA用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒V2.2进行提取，以通用引物8f(5,- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 )和 1492r(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)(上海华大基因)进行 PCR扩增。退火温度为52 !。PCR产物为1 800 bp左右，用pMD19-

10、T Vector连接PCR产物，挑取 阳性克隆质粒，送往杭州有康生物科技有限公司测序回。测序后的序列在NCBI核酸数据库，BLAST比对分析，用Clustal X 1.83对同源性超过95%序列 进行分析，用软件MEGA(7.0)利用Neighbor-Joining (NJ)法构建系统进化发育树9&。2结果与讨论2.1 内生菌的分离与纯化红叶石楠表面灭菌处理的最后一遍无菌水涂布检测分析，7 W后，没有长出菌落，说明外植体表培养皿浓度/（mol/mL）-部位根/株茎/株叶4株空白对照（CK）00004440.43320.83331.24311.6331合计171611表1红叶石楠分离菌株情况面消

11、毒干净。从不同铅浓度的培养基上 分离得到的细菌为内生细菌，共分离纯 化出44株内生细菌,其中在根、茎、叶 的部位分别分离出17株、16株和表1红叶石楠分离菌株情况2.2形态学与耐铅生理浓度检测菌落为圆形，边缘无锯齿状，乳白 色,表面光滑。经显微镜观察，所有菌株 革兰氏染色结果均为G+菌,其菌株形态 为杆状和球状。淀粉水解酶实验的结果 都为阳性（ + ）,40株甲基红试验测定结果 为阴性（-）,39株菌VP试验结果为阳性（ + ）,4。株过氧化氢酶结果为阳性（ + ）（表2）。表2生理生化结果序号革兰氏染色形状甲基红试验V-P试验过氧化氢酶淀粉水解试验S1+杆状-+S2+杆状-+S3+杆状-+S

12、4+杆状-+S5+杆状+S6+杆状-+S7+杆状-+S8+杆状-+S9+杆状-+S10+杆状-+S11+杆状-+S12+杆状+S13+杆状+S14+杆状-+S15+杆状-+S16+杆状-+S17+杆状-+S18+杆状-+S19+杆状-+S20+杆状-+S21+杆状-+S22+杆状-+-+S23+杆状-+S24+杆状-+S25+杆状+S26+球状-+S27+杆状-+S28+杆状-+续表2序号革兰氏染色形状甲基红试验V-P试验过氧化氢酶淀粉水解试验S29+杆状-+S30+杆状-+S31+杆状-+S32+杆状-+S33+杆状-+S34+杆状-+S35+杆状-+S36+杆状-+S37+杆状-+S38+

13、球状-+S39+球状-+S40+球状-+S41+球状-+S42+球状-+S43+球状-+S44+球状-+2.3内生细菌16SrDNA分子鉴定根据细菌的形状、甲基红试验、VP试验结果和过氧化氢实验结果，提取S5、S11、S12、S13、S15、 S16、S17、S22、S25和S43这些内生细菌的DNA,扩增各自的16S rDNA序列，并送去测序#测序分析结 果表明,这些内生细菌16SrDNA序列有3种,其中,S43为一种菌，S5、S12、S13和S25/16S rDNA 序列相同，S11、S15、S16、S17和S22/16SrDNA序列相同$将这3段16S rDNA序列上传到NCBI数 据库

14、，收集同源性高的序列$利用MEGA(7.0)将红叶石楠内生细菌菌株与其同源性较高的菌株16S rDNA序列构建系统进 化发育树(图1)。从不同菌株的遗传距离上进行比较分析，初步推断出S5为假单胞菌属(Pseudomonas) ，S17为蜡样芽抱杆菌属:Ba/cillus cereus)，S43为不动杆菌属(Acinetobacter) $2.4讨论生长在重金属污染的地区植物，随着人类和动物的取食，积累在植物体内的重金属也会随之进 入人类体内，进而危害人类的健康。因此在重金属污染的土壤修复过程中，应避免可食用的植物如 蔬菜和一些易被动物食用的草本植物用于重金属污染土壤生物修复$大部分木本植物因为

15、其不进 入食物链，在植物修复重金属污染过程中将发挥重要的角色$微生物与植物的共生关系促进植物在铅胁迫的条件下生长的现象，在小白菜四、扁豆12=等植物 上也有发现相类似情况$芽抱杆菌属能帮助植物在重金属离子胁迫下，产生生长激素如IAA等回, 以利于植物生长$芽抱杆菌属能帮助小白菜在铅胁迫下，减少Pb的吸附量,以提高叶绿素含量,促 进植物生长四$不动杆菌和假单胞菌属在Pb的胁迫下能产生出IAA等生长素，在植物某个部位、组 织或结构中生长素含量越多,对植物生长和吸收重金属便越有利1416=$芽抱杆菌属和假单胞菌属可 以溶解土壤中有机磷，促进植物对磷的吸收回;假单胞菌属具有ACC脱氨酶,能够阻止植物产

16、生乙 烯，可以促进植物根的生长四。因此推断出这些内生细菌与红叶石楠的共生关系在一定程度上能防 止铅离子对其的伤害$Bacillus sp.(KT183546.1)Bacillus sp. (FJ984612.1)Bacillus sp. (KM575990.1)-Bacillus cohnii(!VFJ177123.1)Bacillus thuringiensis (JX010983.1) rS17 Bacillus cereus (WN746189.1)Bacillus sp. (JF701945.1)Bacillus sp (MT4596017.1)I Bacillus sp.(JX010

17、998.1)-Bacillus sp. (IVK602552-1)Bacillus sp. (MG786930.1)j Bacillus sp. (KJ944107.1)L Bacillus sp.(KF863846.1)Bacillus sp. (MF926244.1)r Bacillus sp_ (MT023681.1)Bacillus sp. (HQ639025.1)r Bacillus sp. (KC119103.1)Bacillus sp. (EU584539.1)-Bacillus anthracis (IVN746216.1)Stenotrophomonas maltophili

18、a (MG905269.1)Stenotrophomonas sp. (MN208463.1)-Stenotrophomonas sp. (JN400505.1)Stenotrophomonas sp. (KJ933407.1)S5r Pseudomonas sp. (JN626958.1)L Pseudomonas sp (MH703466.1)Uncultured bacterium (KF101147.1)_ Azinetobacter sp. (KY681817.1)I Uncultured bacterium (HM319302.1)-j Uncultured bacterium (JF905988 1)I Acinetobacter sp. (KC236501.1) I Acinetobacter sp. (GQ503319.1)J Uncultured bacterium (GU455145.1)| Uncultured bacterium (KX022333.1)I Acinetobacter sp. (JX566544.1)Acinetobacter sp. (KP152591.1) Acinetobacter sp. (KX989241.1)-Acinetobacter sp. (JQ0821