免疫印迹技术分析树舌多糖GF对H22肝癌移植瘤PTEN蛋白表达的影响

1、免疫印迹技术分析树舌多糖GF对H22肝癌移植瘤PTEN蛋白表达的影响【摘要】目的探明树舌多糖GAPSGF对H22肝癌移植瘤PTEN蛋白表达的影响。方法昆明种小鼠随机分为两组：肿瘤组和树舌多糖组，接种后各组肌肉注射给药，分别给与生理盐水和树舌多糖GF。连续10d，于末次给药24h，处死小鼠，剥离肿瘤组织。esternblt技术检测各组样品PTEN蛋白的表达量。结果肿瘤组检测结果为阴性，树舌多糖组检测结果为阳性。结论树舌多糖GF抗肿瘤的作用靶点之一可能为抑癌基因PTEN。【关键词】树舌多糖GF；H22肝癌移植瘤；PTEN蛋白StudyntheEffetsfGAPSGFntheExpressinfP

2、TENinTransplantatinTurfHepataH22byesternBltTehnlgyAbstrat：bjetiveTinvestigatetheinfluenefganderaapplanatuplysaharidesGAPSGFntheexpressinfPTENprtEinintransplantatinturfhepataH22.ethdsiefKuningstraineredividedrandlyinttgrups:turgrupandGAPSgrup.AlltheieereinulatedithhepataH22,thenereinjetedithnralsalin

3、eandGAPSGFrespetivelyfr10days.Afterthelasttiefinjetin,alltheieerekilledanderepeeledfftheturtissueandbservedtheexpressinfPTENprteinbyesternblt.ResultsTheresultfturgrupasnegative,hereastheresultfGAPSGFgrupaspsitive.nlusinneftheanti-turatintargetfGAPSGFaybetheantingenePTEN.Keyrds：GAPSGF；Transplantatint

4、urfhepataH22；PTENprteins树舌Ganderalipsiense，又称“老牛肝“扁芝或“扁木灵芝，是一种大型担子菌，其性平，味微苦，临床多用于治疗乙型肝炎、食道癌、神经衰弱和肺结核等病症。树舌多糖GF是从树舌中提取的一个组分，有明显抗肿瘤的作用，能显著抑制H22肝癌移植瘤p53基因1，N-Ras基因2的表达和进步p163，Rb4的表达量。本研究采用esternblt技术研究树舌多糖GF对H22肝癌移植瘤PTEN蛋白表达的影响，旨在为树舌多糖GF寻找新的分子靶点，为其作为抗肿瘤药物的临床应用提供更为充分的理论根据。1材料与方法1.3方法1.3.1造模与给药雌雄各半的昆明种小鼠

5、20只，随机分为2组，每组10只：分别为肿瘤组和树舌多糖组。选择710d生长良好的瘤株，无菌取腹水，用生理盐水13稀释至2.0106个/l，0.2%台盼蓝染色，计活细胞数大于95%，以0.2l/只接种于小鼠右侧腋窝下。接种6h后，各组肌肉注射给药0.1l/只。树舌多糖组按50g/kg/d给药，肿瘤组小鼠给与生理盐水，连续10d。1.3.2可溶性蛋白的提取于末次给药24h，处死小鼠，剥离肿瘤组织，置于冰冷的研钵中，加适量液氮研磨。然后置于3倍体积细胞裂解液中，用玻璃匀浆器进展匀浆。在匀浆液中参加20g/lDNase和5g/lRNaseA，4作用15in，再振荡混匀5in，然后4，25000g离心

6、45in，小心避开外表的脂质层取上清液，即为蛋白提取物。lry法测定蛋白质浓度，-75保存。各组样品等量混合，即为esternblt所用样品。2结果esternblt法检测PTEN的结果见图1。图中泳道1为蛋白分子量arker，泳道2为肿瘤组样品，泳道3为树舌多糖组样品。从图中可以看出，肿瘤组样品esternblt的结果为阴性，而树舌多糖组样品的染色结果为阳性PTEN蛋白的分子量为47KD。1arker2肿瘤组3树舌多糖组图1esternblt法检测PTEN略3讨论PTEN是继p53之后又一明星抑癌基因，具有双专一磷酸酶活性，在酪氨酸磷酸酶和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶介导的信号传导过程中具有重要的作

7、用,可以通过特异性地抑制三磷酸磷脂酰肌醇激酶(PI3K)依赖的蛋白激酶B(PKB或AKT)的激活5，催化二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)与PIP3脱磷酸,借此调节细胞生命活动的。已在多种肿瘤中发现PTEN的突变或缺失。其抑制肿瘤生长的主要作用表如今：可能通过诱导细胞G1期阻滞抑制细胞周期进展和诱导细胞的凋亡作用来抑制细胞生长；PTEN的双特异性磷酸酶(DSP)可通过参与整合蛋白所激发的跨膜信号传导和下调聚集黏附的黏着斑激酶(FAK)磷酸化程度,而抑制细胞的趋化、迁移、铺展、聚集和黏附6，7；主要通过调节蛋白质的合成而调节未分化和已分化细胞的体积8，调节未分化细胞的细胞增殖9；PTEN下调血管内皮生

8、长因子(VEGF)RNA的程度，可以影响其分泌，从而调控血管生长10，进而影响肿瘤的生长和转移。PTENDNA的5端的非翻译区中有多个G重复序列，为甲基化提供了调节可能。高甲基化使PTEN基因处于静止态,造成PTEN的低程度转录或PTEN蛋白的缺失11，从而消除了PTEN对一些肿瘤细胞系生长的抑制才能。本研究esternblt的结果显示，肿瘤组样品结果为阴性，而树舌多糖组样品的染色结果为阳性。这说明，PTEN蛋白在小鼠H22肝癌移植瘤中表达量大幅度降低，或发生基因的缺失，应用esternblt法检测不到它的表达；树舌多糖GF可以诱导H22肝癌移植瘤PTEN的表达或阻止其缺失，故而应用esternblt法可以检测到它的表达。而小鼠H22肝癌移植瘤PTEN基因的表达产物明显减少很可能是由于肿瘤细胞PTEN