第讲基因工程的酶学基础

1、生物技术核心课程Principles of Genetic Engineering基 因 工 程 原 理生命学院遗传与基因工程教研室 余丽芸 教授博士基因工程原理纲要第一讲 基因工程概论第二讲 基因工程的主要技术第三讲 基因工程的酶学基础第四讲 基因克隆的载体与受体第五讲 目的基因的克隆与分离第六讲 克隆基因的检测与功能鉴定第七讲 克隆基因的表达与产物纯化第八讲 基因表达的调控用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸外切酶核酸修饰酶第三讲 基因工程的酶学基础单链DNA内切酶核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶

2、。其中专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶(RNase)，而特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸酶(DNase)。按水解断裂核酸分子的方式不同，可分为两种类型：一类是从核酸分子的末端开始，一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫核酸外切酶(exonuclease)；另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫核酸内切酶(endonuclease)。第一节 限制性核酸内切酶一、基本概念及其生物功能限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。第一节 限制

3、性核酸内切酶一、基本概念及其生物功能据1994年美国出版的分子生物学百科全书统计，仅II型限制性核酸内切酶就已从各种不同的微生物中分离出了2300种以上，可识别230种不同的DNA序列。2. 性质内切酶。主要是从原核生物中分离纯化出来。即在核酸分子链的内部制造切口的酶。帮助细菌限制外来DNA的入侵3. 功能细菌的限制和修饰系统（R/M体系）1. 来源限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（1）限制（Restriction）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification） Dam甲基化酶GATC 腺嘌呤N6位置引

4、入甲基 Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基I 型限制性内切酶 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型II 型限制性内切酶 III型限制性内切酶 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。（1）识别位点序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC1. I型限制性内切酶 如 EcoB和 EcoK。未甲基化修饰的特异序列。需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用机理在距离特异性识别位点约10001500 bp处随机切开一条单链。Recognize sit

5、ecut1-1.5kb（2）切割位点1970年，H.O. Smith和K.W. Wilcox首先从流感嗜血杆菌d株中分离出来。 （1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。 与DNA的来源无关。2. II型限制性内切酶 分离的第一个酶是Hind II，其次是 Hind III EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 产生粘性末端EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 产生平齐末端（2）切割位点切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt en

6、d）。如：识别位点处。（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型： 5端凸出（如EcoR I切点）GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-5 5-3 3-5 EcoR I等产生的5粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoR I 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A

7、-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OHPOHPCTGCAG 3端凸出（如Pst I切点）GACGTC 5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC Pst I等产生的3粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5Pst I 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5

8、OHPOHP 连接便利 （3）粘性末端的意义i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。 补平成平齐末端凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 5末端标记凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。Pvu II等产生的平头末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5Pvu II 37 5 G-C-T-C-A-G-OH

9、 P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 识别位点的序列相同的限制性内切酶。 （4）同裂酶 (Isoschizomers) 完全同裂酶： 识别位点和切点完全相同。 如Hind 和Hsu I。Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5 Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。 不完全同裂酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、

10、Bgl 、Bcl I、Xho 等 （5）同尾酶 (Isocaudamers）5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 BamH IBcl I5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5 Bgl 5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5 Xho U代表嘌呤；Y代表嘧啶。5-GATC-3 3-CTAG-5 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。？5-G 3-CCTAG GATCT-3 A-5 BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5 BamH IBgl Sau 3A限制性内切酶的识别和酶切活性

11、一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。 （6）限制酶的酶活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。 星号（*）活性EcoR I和BamH I等都有*活性。在低盐、高pH（8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoR I：使用的时候要特别注意！在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。（7）s型限制性内切酶移动切割（shifted cleavage):GACGCNNNNN Hga ICTGCGNNNNNNNNNN 5 3 3. III型限制性内切酶 在完全

12、确定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM (S-腺苷蛋氨酸)的激活作用。在基因工程操作中用途不大。EcoP1: AGACCEcoP15: CAGCAG核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I型内切酶II型内切酶III型内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、 Mg2+和SAMMg2+ ATP、 Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC回文序列，旋转对称 （IIs型除外）EcoP1: AGACC Ec

13、oP15: CAGCAG切割位点在距离识别位点至少1000 bp处随机切开一条单链。位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3端24-26bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用用处不大1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下： 三、限制性内切酶的命名用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophi

14、lus influenzae）用Hin表示。4. 限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50 mM pH 7.5MgCl210 mMNaCl0 - 150 mMDTT1 mM0 - 50 mM 低盐酶100 mM 中盐酶150 mM 高盐酶Volume20 - 100

15、 mlT T37 1 - 1.5 hr1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 mg 标准DNA所需的酶量四、 II 型限制性内切酶酶解反应的操作II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5 GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT33 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5BamHI SmaI5 GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT3 3 CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA55 GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT33 CGATGTACCTAGGG CC

16、CAAGCGTA5四、 II 型限制性内切酶酶解反应的操作II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.42.5倍体积的冰冷乙醇冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥四、 II 型限制性内切酶酶解反应的操作DNA中的杂质如蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、NaCl等都会影响酶的活性。 1. DNA的纯度 五、影响限制性内切酶活性的因素纯化DNA 加大酶的用量， 1g DNA 用 10U 酶延

17、长保温时间 扩大反应体积（ 20l）一般采取大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位 引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影响 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基2. DNA的甲基化程度 基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApa I Bcl I

18、Mae II Taq I30 50 50 65Apy I BstE II Mae III30 60 55Ban I Mae I Sma I50 45 253. 温度 是影响限制酶活性的重要因素。4. 缓冲液(Buffer) 缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity

19、现象。 EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者5AATT3五、限制性内切酶对DNA的消化1. 内切酶与识别序列的结合模式 1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体衍射发现II型限制性内切酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。2. 完全消化 12341234只有有限数量的酶切位点被切开。 通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。3. 局部消化 123414 5. 几种常用限制酶识别位点大多数酶可用65 oC温育

20、5分钟失活。 或用乙醇沉淀DNA。4. 限制酶酶切反应的终止 6. 限制性内切酶识别序列的交叉列表 AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG * *MaeII Hpac MspIc * Alu I * A*T Nla A*T ApoI Hind Afl III AgeI BsrFI A*T A*T SspI A*T AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG A*T Nsp7524 C*G NcoI StyI Dsa I XmaI AvaI C*G NdeI C*G Pml I BsaAI PvuII NspBII SmaI C*G C*G G*C EcoRI

21、 ApoI NgoMI BsrFI AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG G*CBseHI G*CEcl136II EcoRV NaeI G*CG*C AatII SacI BanII HgiAI Bsp1286 SphI Nsp7524 T*A BspHI BspMII T*A T*A SnaBI BsaAI T*A T*A CGCG CTAG GATC GCGC GGCC * MboIc Sau3AIc *BfaI HinpI * BstUI DpnI HaeIII * HhaIA*T A*T MluI Afl III SpeI Bgl II BstYI A*T A*

22、T Eco47III StuI A*T CGCG CTAG GATC GCGC GGCC A*T HaeIIC*G DsaI AvrII StyI EagI EaeI GdiII C*G C*G NspBII C*G SacII PvuI C*G BsiEI BsiEI G*C BssHII NheI BamHI BstYI KasI BanI Bsp120I CGCG CTAG GATC GCGC GGCC G*CNarI BsaHI G*CG*CG*C T*A BbeI HaeII ApaI BanII Bsp1286 T*A XbaI Bcl I EaeI T*A NruI FspI M

23、scI T*A T*A GTAC TATA TCGA TGCA TTAA * *Csp61 TaqI MseI * RsaI * A*T A*T A*T ClaI AseI A*T ScaI A*T GTAC TATA TCGA TGCA TTAA A*T Nsi I C*G Bsi WI SfcI XhoI AvaI AvaI SfcI C*G C*G C*G C*G PstI G*C Asp718BanI Sal I ApaLI GTAC TATA TCGA TGCA TTAA G*CAccI AccI G*CBsrl107I HincII HpaI HincII G*C G*C KpnI

24、 Bsp1286 HgiAI T*A T*A BstBIT*A DraI T*A T*A 从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。第二节 DNA 连接酶一、DNA连接酶（ligase)的发现1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化两条DNA的末端之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶。 修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键DNA连接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OHPOHP5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T

25、-C 5nicknick二、DNA连接酶的基本性质与特点DNA连接酶的基本性质DNA连接酶DNA连接酶的基本性质修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键T4-DNA连接酶5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5OHPnick5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5DNA连接酶DNA连接酶的基本性质连接多个平头双链DNA分子：5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A

26、-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶1. 两种DNA连接酶只能连接粘性末端。DNA ligase的特点（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA 3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+2. 连接条件1. ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、连接反应的机理2. ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3. AMP与连接酶的赖

27、氨酸-氨基相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+H3NAMPATPPPi4. AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP5. 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50 - 100 mM pH 7.5MgCl210 mMATP0.5 - 1 mMDTT5 mMVolume10 - 20 mlT T4 - 15 4 - 16 hr1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全连接 1 mg l-DNA（H

28、ind III片段）所需的酶量四、连接反应的条件连接酶反应的最佳温度是37C。四、连接反应的条件最佳温度但在37下粘性末端的结合很不稳定。实用温度所以一般采用 416 C。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。1. 插入片段与载体的浓度比例 2. 反应温度12.5。五、影响连接反应的因素1020倍。一般1416平头双链DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增

29、加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM5.平末端DNA片段的连接 连接平末端DNA 分子的方法除了直接利用T4DNA连接酶外，还可以先用末端核苷酸转移酶给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶进行连接。 常用的平末端DNA片段连接法： （1）同聚物加尾法 （2）衔接物连接法 （3）接头连接法（1）同聚物加尾法 利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能，它能够将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3OH基团上。（1） 同聚物加尾法 Poly（dA）尾巴：在由核酸外切酶处理过的DNA，以及dA

30、TP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3OH末端将会出现单纯由腺嘌呤核苷酸组成的DNA单链延伸，这样的延伸片段，称之为Poly（dA）尾巴。 Poly（dT）尾巴：如果在反应混合物中加入的是dTTP，那么这种DNA分子的3OH末端将会形成Poly（dT）尾巴。 Poly（dA）尾巴同Poly（dT）尾巴是互补的，因此任何两条DNA分子，只要分别获得Poly（dA）尾巴和Poly（dT）尾巴，就会彼此连接起来。按照同样的道理，也可以用给DNA分子3OH末端加上Poly（dG）尾巴，给另一种DNA分子3OH末端加上Poly（dC）尾巴的方法，使2个不同DNA分子连接起来。(2)

31、衔接物连接法 衔接物：是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。（3） DNA接头连接法 DNA接头：是一类人工合成的一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。图313所显示的是一种具BamH粘性末端的典型的DNA接头分子。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组 。第三节 DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆

32、转录酶1. 共同特点把dNTPs连续地加到引物的3-OH端。2. 主要区别T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。二、常用的DNA聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。DNA聚合酶35外切酶活性53外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中Taq DNA聚合酶无有快高3. 常用DNA聚合酶的特性比较三、DNA聚合酶在基

33、因工程中的用途1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I主要用来制备带放射性标记的DNA探针。（1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质一条单链多肽。53外切酶活性位于N端。 用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的53外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。 底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ 带有3-OH游离端的引物 DNA模板（2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件-OH5 3 dNTPs标记 核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I 制备探针已知序列的核酸片断显示位置与互补的待测序列杂交标记

34、已知序列的核酸片断 探针的标记方式标记已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断5 3 DNA聚合酶I 对探针序列的标记切口转移法(nick translation )：放射性同位素标记：DNA聚合酶I 同时具备53外切酶活性和53的聚合酶活性（以及35外切酶活性）。53外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3一侧补上一个新的核苷酸。切口切口5 5 3 3 5 3 5 3 纯化的DNA片断DNase I 制造单链切口DNA Pol I 进行切口转移一种-32P-dNTP和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3

35、 3 3 3 32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记2. Klenow fragment具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。（1）Klenow fragment的性质DNA Pol I Klenow fragment (76KD） 枯草杆菌蛋白酶 3端补平5 5 klenow DNA 3末端标记补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途3隐蔽末端的DNA片断Klenow fragment补平根据末端的顺序选择一种 -32P-dNTPs末端标记的DNA 限制性内切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA

36、3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5 3 3 5 5 3 引物（1） T4 DNA聚合酶的性质3. T4 DNA聚合酶从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。有53聚合酶活性和35外切酶活性（降解单链更快）。 来源 酶活性 特点当没有dNTP时，T4 DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隐蔽端。如果

37、只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。5 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶无dNTPsT4 DNA聚合酶有dNTPs5 5 （2） T4 DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法）用35外切酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隐蔽端、5隐蔽端）制造出3隐蔽端。 再利用它的53聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。 补平隐蔽末端 DNA 3末端标记酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsT4 DNA聚合酶 （35外切）DNA酶切片断T4 DNA聚合酶 （53聚合）5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 内切酶

38、切无dNTPsa. 放射性标记的优缺点：制作简单、 高比放射性、 放射自显影效果好。优点：缺点：半衰期短（32P只有14.3天）、 不易保存、 对人体有害。 要求在专门实验室操作。b. 非放射性标记i）生物素标记：生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素连接酶（biotin ligase）催化与蛋白质共价结合。纯化的DNA片断DNase I 制造单链缺口DNA Pol I 进行缺口转移生物素-dTTP和dNTPs

39、 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中光促生物素标记生物素连接臂光敏基因探针序列探针序列生物素连接臂光敏基因+光照抗生物素蛋白（avidin）：链霉抗生物素蛋白（streptavidin）：生物素的识别亲和素：是一种鸡卵清蛋白。细菌中avidin的类似物。能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：ii）地高辛标记：可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒 (kit)。地高辛的结合物是抗地高辛抗体。盖士人读书，第一

40、要有志，第二要有识，第三要有恒。有志则断不甘为下流；有识则知学问无尽，不敢以一得自足，如河伯之观海，如井蛙之窥天，皆无识者也；有恒则断无不成之事。此三者缺一不可。曾国藩家书iii）偶联酶及其底物常用的两种酶：辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRPO） 碱性磷酸酶 （Alkaline Phosphatase, AP）催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。酶的作用：化学发光底物HRPO和AP的显色反应底物发光反应机理iv）用非放射性标记的探针检测原理生物素探针序列待测基因亲和素酶底物中间产物产物发光探针DNA用生物素或地高辛标记。亲和素或地高

41、辛抗体与酶偶联。酶催化一个发光或显色反应。亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。核酸探针杂交筛选法的缺点是：只检测是否有外源DNA插入，而不论该DNA是否表达出产物。4. T7 DNA聚合酶（1）来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： T7基因5编码的大亚基：有53聚合酶和35外切酶活性。 大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。 增加大亚基对模板的亲和性。（2）T7 DNA聚合酶的特点 持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。 35外切酶活性高单链和双链都能降解。 不受DNA二级结构的影响其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍 进行末端标记 以大分子量DNA为

42、模板的合成如M13 补平隐蔽末端（3）T7 DNA聚合酶的用途取代合成法标记3末端。与T4 DNA聚合酶相同。合成补平3隐蔽末端； 水解修平3突出末端。5. 修饰后的T7 DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途 DNA测序双脱氧法。 标记DNA 3隐蔽末端 更有效地补平末端6. 逆转录酶最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。（1）来源RNA肿瘤病毒。（2）AMV的性质由和

43、两条多肽链组成。 链有反转录活性和 RNaseH活性。RNaseH： 链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。 以53或35方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。RNaseHRNA DNARNA DNA（3）逆转录酶的用途 链RNA-DNA杂交双链中53DNA外切酶活性。 合成cDNA以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。AAAAATTTTT5 3 mRNA 5 cDNA 合成DNA探针用随机引物（random primer）或oligo dT做引物。随机引物：随机顺序形成的寡聚DNA片断。（理论上它能与各种序列的模板结合） RT-PCR用的模板克隆某个基因时，

44、用其mRNA反转录出cDNA第一链。第四节 DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶1. 来源小牛胸腺。2. 组成大小两个亚基。3. 特性（1） 53DNA聚合酶活性（terminal transferase） 不需要模板！ 需要3-OH、二甲胂酸缓冲液。 底物可以是单链DNA、 是3-OH突出的双链DNA、 平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。 随机添加的dNTPs。 如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。DNA 5 3 TTTdTTP ，末端转移酶4. 末端转移酶的用途（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。外源DNA载体DNA5 3 5 3

45、CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端转移酶（2）再生酶切位点便于回收克隆片断。AAGCTT TTCGAA5 5 Hind酶切A TTCGAAGCTT AKlenow补平AAGCT TTCGAAGCTT TCGAAAAGCATTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA末端转移酶dTTPAAAAAA外源DNA（3）非放射性标记DNA片断的3端AAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAAAAAAAAHind位点Hind位点连接催化非放射性标记物参入DNA片断的3端。（生物素-11-dUTP等）二、T4多核苷酸激酶1. 来源T4噬菌体的pseT基因编码。 从T4感染大肠杆菌细

46、胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2. 功能催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5-OH端。不论5-OH端突出与否。5 3 HO-OH5 3 HO-OH3 P-OH5 3 HO-P5 ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5端。但天然的DNA的5端都是磷酸化的。3. 多核苷酸激酶的用途DNA 5-OH端磷酸化、标记DNA的5端。5 3 HO-OH5 3 HO-OH3 32P-OH5 3 HO-32P5 (-32P)ATP多核苷酸激酶3 P-OH5 3 HO-P5 碱性磷酸酶（1）正向反应（forward reaction）（2）交换反应

47、标记法反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与DNA5端的磷酸交换。3 P-OH5 3 HO-P5 3 32P-OH5 3 HO-32P5 (-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反应效果不理想。 三、碱性磷酸酶1. 碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。具有抗热性。SDS中加热68oC可完全失活。2. 碱性磷酸酶的特性催化脱掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。3 P-OH5 3 HO-P5 5 3 HO-OH5 3 HO-OH碱性磷酸酶3. 碱性磷酸酶的功能（1）防止线性化的载体份子自我连接单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTT TTCGAAHind酶切A-OH TTCGA-P