从基因到蛋白质课件

1、从基因到蛋白质-生物基因的表达及调控苏 川南京医科大学病原生物学系 86862774江苏省病原生物学重点实验室 86862773一、基因表达的概述： 从基因到蛋白质中心法则： DNAmRNA蛋白质转录逆转录翻译复制二、基因表达调控的基本概念与原理：基因表达调控的概念及方式：基因：一个遗传单位，是一段可表达的DNA序列。基因组：一个单倍体细胞或病毒颗粒的全套基因。人类基因组含约4万个基因。基因表达：基因所包含的遗传信息通过转录生成RNA，再经过翻译生成蛋白质的过程。一般而言，在某一特定时刻，高等生物仅有不到15%的基因表达。基因表达调控：基因表达有其特定的规律，并受到机体各种因素的调节和控制。对

2、基因的表达实施精确的控制，使细胞适应不同阶段、不同环境条件下的生长与发育的需要，维持机体正常生命活动，有着重要意义。可诱导基因：基因表达的时间特异性 基因表达的空间特异性（组织特异性）看家基因:2. 基因表达调控的基本原理：原核生物和真核生物的基因表达调控尽管在细节上差异很大，但两者的调控模式和原理极为相似。调节作用主要包括核酸之间的相互作用、核酸与蛋白质之间的相互作用以及蛋白质之间的相互作用。调控作用可能是正向的或负向的。调控点可以位于基因表达过程的各个环节，如基因的激活、转录起始、转录后加工、mRNA降解、蛋白质翻译、翻译后加工和蛋白质降解等。特异DNA序列对基因表达的影响：真（原）核生物

3、DNA分子上的特定序列构成了基因表达的基本信号：起始密码、调控序列、编码序列、终止密码、单拷贝序列、重复序列等。DNA与蛋白质之间相互作用对基因表达的影响：DNA上的特定序列可以与相应的蛋白质结合，这些蛋白质依其作用分为：阻遏蛋白（repressor）：与操纵序列结合，阻遏基因的转录。激活蛋白（activator）：与启动子中的特定序列结合，增强转录。特异因子转录因子（transcription factor, TF）也称反式作用因子（trans-acting factor）：通过与顺式作用元件结合，调节转录活性DNA-蛋白质之间的结合通常是非共价键的形式，通过蛋白质分子中特殊的结构域与DNA

4、分子中双螺旋结构的大沟结合，调节基因的转录。常见的DNA-蛋白质结合域有：螺旋转角螺旋（helix-turn-helix）锌指（zinc fingers）三、原核生物的基因表达调控： 原核生物结构简单、无细胞核，转录和翻译过程耦联在一起，对环境条件的变化反应迅速，可以根据环境因素的变化迅速调整自身基因的表达，满足其生长和繁殖的需要。原核基因表达调控的特点为：普遍存在操纵子调控模式通过特异的阻遏蛋白或激活蛋白调节基因的转录转录与翻译的耦联转录水平的调控：乳糖操纵子的调控：阻遏蛋白对乳糖操纵子的调节四、真核生物的基因表达调控：真核生物基因表达调控与原核不同点在于：转录激活与染色体转录区特定结构相适

5、应正性调节占主导转录与翻译在空间上的分离更多、更复杂的调控蛋白（一）、DNA水平的调控（真核生物表达调控的次要和辅助手段）：染色质（chromatin）结构对基因表达的调控作用：真核基因通常与组蛋白（histone）结合形成核小体，从而保护DNA免受损伤，维持基因组稳定，抑制基因的表达。影响基因表达水平的主要有：组蛋白的含量组蛋白的结构调节蛋白与组蛋白H1和H5竟争和DNA的结合，从而解除组蛋白对基因表达的抑制作用。基因修饰对基因表达的调控作用：胞嘧啶经甲基化为5-甲基胞嘧啶（常出现在5端侧翼序列的GC丰富区），影响DNA特异序列与转录因子的结合，使基因不能转录或阻止转录复合物的形成。基因丢失

6、：在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除掉某些基因的活性。染色体破碎所致的不均等分配。仅发生在低等生物中（原生动物、线虫、昆虫、甲壳类动物等），此现象在高等生物中迄今尚未发现。基因扩增：细胞内某些特定基因的拷贝数专一性地大量增加的现象，它是细胞在短期内为满足某种需要（发育需要、外界环境因素）而产生足够的基因产物的一种调控手段。 （二）、转录水平的调控： 转录水平的调控是真核基因表达调控中最重要的环节，大多数生物基因在转录水平的调控是决定细胞质中mRNA水平的一个最重要方式，调控主要通过反式作用因子和RNA聚合酶的相互作用来实现。反式作用因子是一类细胞核内存在的蛋白质，是与特异的DNA序

7、列（顺式作用元件）结合的调控蛋白。它通过识别并结合上游启动子元件和增强子中的顺式元件，激活或阻遏基因的表达。它包括三个功能域：DNA识别结合域（常有锌指结构）转录活性域（富含某些特定氨基酸如谷氨酰氨）蛋白质相互作用结构域（常具有亮氨酸拉链结构和螺旋环螺旋结构等）。转录起始复合物:转录起始复合物的形成过程有三步：TATA因子结合TATA盒（形成TATA因子DNA复合物）RNA pol识别并结合TATA因子DNA复合物（闭合复合物，DNA双链没有打开，不能启动转录）转录起始因子与RNA pol结合，形成转录起始复合物（开放复合物，DNA双螺旋已打开，可以合成RNA）转录起始的调控：基因表达的转录水

8、平调控主要通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成。调控机制涉及反式作用因子的激活及反式作用因子的作用等。反式作用因子的活性调节：表达调节：迅速合成、迅速降解共价修饰：磷酸化去磷酸化、糖基化配体结合：激素激素受体（是核内的反式作用因子）蛋白质与蛋白质相互作用：max蛋白c-myc蛋白（核内的反式作用因子）（三）、转录后水平的调控： 转录后水平的调控一般是指基因转录后对转录产物进行一系列修饰、加工过程，主要包括mRNA选择性剪切、胞内定位以及mRNA稳定性调节： DNA（核内）转录 mRNA前体 加工成熟mRNA 运输细胞质 mRNA前体加帽、加尾以调控其稳定性：5加帽（ca

9、pping）：7甲基鸟苷三磷酸3端加尾（tailing）：多聚A（Poly A）mRNA前体的选择性剪接（splicing）与拼接：选择性剪切：去除mRNA前体中的内含子选择性拼接：从同一基因产生若干种有部分相同结构的蛋白质，即通过Mrnau前性的选择性拼接而产生不同的成熟mRNA，然后翻译成不同的蛋白质。选择性表达：多基因的基因家族中的各成员在特定的细胞中，在一定的发育阶段和在一定的生理条件下选择性的表达。 RNA编辑的调控：RNA编辑（editing）：是指转录后的mRNA前体在编码区发生核苷酸改变的现象，从而产生出氨基酸序列不同的蛋白质。包括：核苷酸的替换核苷酸的插入或缺失mRNA转运的

10、调控：mRNA前体经过加帽、加尾、剪切等加工后通过核膜孔从核内运至胞浆。大约只有20%的mRNA进入胞浆，留在核内的mRNA约50%会在1小时内降解。（四）、翻译水平的调控： 翻译水平的调控主要是控制mRNA的稳定性和mRNA翻译的起始频率，是一种迅速控制基因表达的方式，是各种高等生物广泛采用的调控方式。mRNA的稳定性，取决于：mRNA的二级结构（不易受外切酶攻击）帽子及其种类polyA尾的长短与mRNA结合的蛋白质的种类mRNA翻译起始的调控（即控制mRNA的可翻译性）：许多蛋白质因子可以影响蛋白质合成的起始，如真核生物起始因子2（eukaryotic initiation factor，

11、eIF-2）的磷酸化会使其活性降低，从而减少蛋白质合成。Recruitment factor可使masked mRNA与核糖体、氨酰基-tRNA、蛋白质结合。真核生物蛋白质合成的自体调控：某些蛋白可抑制其自身mRNA的翻译 （五）、翻译后水平的调控：mRNA翻译的产物新生多肽链大多是没有生物学流行性的，必须经过加工、修饰才能成为有流行性的蛋白质，加工、修饰过程包括：信号肽的切除：由1530个疏水氨基酸组成的信号肽可使蛋白质从内质网膜进入高尔基体。新生肽链的修饰：磷酸化、羟基化、糖基化、乙酰化等。肽链的剪切与正确折叠五、蛋白表达水平的检测蛋白质的检测：SDSPAGE与Western blotEL

12、ISA蛋白质芯片mRNA的检测：Northern blotRT-PCRNuclei run-on基因芯片DNA的检测：PCRSouthern blotDNA测序2. 操作过程样品制备：收集细胞PBS洗涤并离心沉淀细胞加入适量细胞裂解液重悬细胞，置冰上30分钟高速离心，取上清（蛋白溶液）加入等量2XSDSPAGE样品缓冲液煮沸5分钟后上样（或保存于20）制胶（不连续缓冲胶系统）：胶的成份：压缩胶分离胶胶浓度的选择：丙烯酰氨浓度蛋白线性分离范围/KDa1512107.55104312602080369457212加样与电泳：加适量的样品（2001000ug总蛋白量）、对照及蛋白分子量marker1

13、80200volts电泳直到溴酚蓝跑出凝胶（Bio-Rad电泳装置）二抗反应：选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体适量抗体以5%脱脂牛奶或5%BSA稀释室温下1小时（或4过夜）反应加生色底物显色HRP的底物：生色：4氯1萘酚/H2O2发光：ECL溶液（鲁米诺/4碘代酚/ H2O2 ）AP的底物：生色：氮蓝四唑/5溴4氯吲哚磷酸发光：AMPPD拍片或曝光、洗片0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hrp53p21-TubulinTime after irradiationDNA damage induces down-regulation of histone gene

14、 transcription which parallels cell cycle arrest优缺点：优点：不须纯化而直接反映其中单个蛋白表达水平的变化用于观察细胞处理后最后一步变化，结果最可靠、真实实验简单可靠、重复性好缺点：不能反映蛋白质变化的中间过程灵敏度相对较低，多用于检测细胞表达量较大的蛋白质的变化对抗体的依赖度高应用：直接检测蛋白质的有无、变化可直接检测部分蛋白的功能与其它方法结合后，可检测蛋白蛋白相互作用酶联免疫吸附试验（ELISA）原理：将可溶性蛋白质（单一组分或混合组分）固定于酶标板壁上抗原或抗体检测待检蛋白抗体或抗原2. 操作过程（间接法、双抗体夹心法）样品处理：已知样品

15、必须是可溶性蛋白溶于PBS、水等样品可以是单一组分或混合组分包板：适量的抗原以高PH溶液（PH7.67.8的碳酸盐缓冲液）或低PH溶液（PH4.8枸椽酸盐缓冲液）稀释后包被酶标板4反应12天PBS洗涤后，即可使用该板或可较长期保存封闭：4%脱脂牛奶或4%BSA，室温下1小时（或4过夜）一抗反应：选择合适的第一抗体适量抗体以4%脱脂牛奶或4%BSA稀释室温下1小时（或4过夜）反应二抗反应：选择合适的酶标第二抗（第一抗体）体适量抗体以4%脱脂牛奶或4%BSA稀释室温下1小时（或4过夜）反应加生色底物显色：HRP的底物： H2O2/TMB终止：2M H2SO4结果判断：目测法仪器法优缺点：优点：用于

16、观察细胞处理后最后一步变化，结果可靠、真实方法简单（多样）、快速可大批量检测标本敏感性较高缺点：不能反映蛋白质变化的中间过程多用于检测细胞表达量较大的可溶性蛋白质的变化特异性相对较低，重复性相对较差对所用抗体的依赖度高应用：大批量、直接检测可溶性蛋白质的有无、变化Northern Blot原理：将RNA固定于尼龙膜上以DNA探针识别待检mRNA2. 操作过程总RNA提取：用Rneasy Mini Kit抽取总RNA （QIAGEN公司）用700ul SW1洗一次用500ul RPE洗2次用50ul RNase free ddH2O洗脱两次取2ul加入98ul ddH2O，测取OD260/280

17、并计算RNA浓度及总RNA得量制胶（变性11.5%Agarose胶）：制备100ml含有2.2mol/L甲醛的1.5%的琼脂糖凝胶，加1.5克琼脂糖凝胶粉到72ml灭菌水中，煮沸溶解后置55水浴，均衡后10ml MOPS电泳缓冲液和18ml去离子甲醛，在化学通风橱内灌胶加入足够量的1XMOPS电泳缓冲液，预电泳约5分钟。备用。RNA样品预处理：在一灭菌EP管中建立变性反应：RNA（多达20ug）2.0 ul10XMOPS电流缓冲液2.0 ul甲醛4.0 ul甲酰氨10.0ul溴化乙淀1.0 ul6520分钟变性，立即置冰上10分钟简短离心后备用电泳：上样：等量总RNA/样品45volts/cm

18、电泳57小时。不能用过高的电压！转移：经典方法：搭建“金字塔”，转移过夜。支持物 重物（400克）琼脂糖凝胶滤纸滤纸桥尼龙膜滤纸吸水纸玻璃板20XSSC上行毛细管转移示意图DNA探针的制备：在一灭菌EP管中建立反应：2.0ul模板GAPDH PCR产物（150bp,100ng/ul）6.0ul10 X EcoPol buffer6.0uldNTPs（无dCTP）3.0ul5-GAPDH(100ng/ul)3.0ul3-GAPDH(100ng/ul)31.0ul ddH2O煮沸10分钟，立即置冰上10分钟：加入：2.5ulKlenow6.5ul32P-dCTP室温下孵育6小时过柱纯化已标记探针（

19、Phamarcia试剂盒）取相等CPM量RNA，加入2ml TES/0.6M NaCL10mM TES10mM EDTA0.2%SDS在杂交炉中，68反应过夜用2XSSC/0.1%SDS洗膜三次用0.1XSSC/0.1%SDS洗膜三次曝光于X光胶片Crosslink预杂交加入10ml杂交混合液， 68反应45分钟杂交H2AH3H4GAPDH0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hrTime after irradiationC.H2BH1DNA damage induces down-regulation of histone gene transcription

20、which parallels cell cycle arrestHCT116（p53+/+,p21+/+)D.E.0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hr24 hrH2AH4GAPDHTime afer GFP-p21 inductionH1H2BH3Inhibition of CDK activity disperses NPAT from histone gene promoters and down-regulates histone gene expressionA.0204060801001200468101214Time after irradiat

21、ion (hr)% controlS phaseH1H2AH2BH4H2AH4GAPDHH2BH10 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hrTime after irradiationHCT116（p53-/-,p21+/+)Down-regulation of histone gene expression induced by DNA damage depends on p53 and p21S phaseH1H2AH2BH4BH2AH4GAPDHH2BH1Time after irradiation0 hr2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hr

22、020406080100120% control0468101214Time after irradiation (hr)2HCT116（p53+/+,p21-/-)Down-regulation of histone gene expression induced by DNA damage depends on p53 and p21优缺点：优点：真实反映细胞处理后mRNA水平的变化敏感性较高缺点：使用同位素不能反映蛋白质变化的最终结果及mRNA变化的原因多用于检测细胞内较高丰度mRNA的变化实验过程较为复杂应用：观察细胞处理后mRNA水平的变化，以印证蛋白质的变化Nuclei Run-o

23、n原理：迅速冷冻，使细胞核内正在转录的mRNA复合体处于冻结状态加入ATP/GTP/CTP/32P-UTP，重新恢复mRNA的转录并使之结束（标记冻结时正在转录的mRNA)，提取mRNA以cDNA探针及对照cDNA标记尼龙膜后检测目标mRNA细胞核的提取处理细胞（培养于10厘米培养皿）吸去培养液，迅速将细胞放于冰上用10ml冰预冷的PBS洗细胞一次加10ml冰预冷的PBS，刮下细胞，移入离心管500g离心5分钟后弃去液体边混悬边加入4ml NP40裂解液10mM Tris-HCL, PH7.410mM NaCL3mM MgCL20.5% NP-40置冰上孵育5分钟，同前离心，弃去上清2. 操作过程以4ml NP40裂解液重悬