研究生抗体技术第1讲课件

1、单克隆抗体技术生物技术学院 董文其 一、学习目的了解和掌握细胞培养基本知识和技能了解和掌握单克隆抗体制备技术有关培养的几个概念细胞培养（cell culture） 组织培养（tissue culture） 器官培养（organ culture） 离体细胞在培养过程中不出现分化、不形成组织。 取自动物的某类组织，在培养过程中细胞一直保持原本已分化的特性，该组织的结构和功能不发生明显变化。 整个器官或器官的一部分在体外条件下的保存或生长。细胞系（cell line）细胞株（cell strain）原代培养（primary culture）传代（passage或subcultuer）克隆（clone

2、） 系原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系，强调细胞来源。 系通过选择法或克隆形成法,从原代培养物或细胞系中挑选出单个细胞培养形成的具特定生长特性的细胞培养物，强调细胞特性。 指取自新鲜组织的细胞在传代前称为原代培养。 指由一个细胞增值形成的群体后代。有关培养细胞的几个概念 体外培养的细胞繁值到一定程度就不再繁殖了（由于表面接触抑制），此时将细胞按一定比例创新分配到新的培养体系中，细胞就可以重新生长，这样就可一代一代传下去。细胞的长期保存与复苏低温冷冻保存（液氮） 10二甲基亚砜（DMSO)慢速冷冻细胞程序降温仪先4冰箱，后-20冰箱，最后液氮。细胞密度以25106为宜。一定要作好标记 冻存

3、细胞的复苏 复苏温度：3739水浴 快速复苏13 /min 至-30 1530/min 至-196 细胞培养物污染及其防治 细菌污染：用高浓度抗生素（青、链霉素）霉菌污染：用抗真菌药（制霉菌素、两性霉素） 支原体污染：比较棘手，有人建议用卡那霉素、庆大霉素。 来 源： ? 分子水平：？细胞水平：？个体水平：？社会生活：？克隆概念嫁接分子（基因）克隆细胞克隆动物克隆（无性繁殖）克隆是英文“ clone ”的音译，来自希腊文 klon ，原意为苗或嫩枝 单克隆抗体的特点特 异 性均一性（重复性）可 大 量 制 备单克隆抗体的制备原理（融合细胞的筛选） 基于酶缺陷和药物抗性筛选融合细胞：最常用HAT

4、培养基筛选系统。H为次黄嘌呤（hypoxathine），A为氨基蝶呤（aminopterin），T为胸腺嘧啶（thymidine）。目的性创新性可行性二、实验设计（条件、仪器）超净工作台二氧化碳培养箱倒置显微镜液氮储存器高压灭菌器器超纯水仪电热恒温干燥箱三、实验器材的消毒干烤：玻璃器皿高压蒸汽灭菌：玻璃、橡胶、金属等，有时培养液过滤除菌：培养基、试剂等紫外线杀菌：实验室空气、物台，有时塑料制品射线杀菌：不耐热物品熏蒸消毒：实验室、无菌室等化学消毒剂消毒：手、物品表面等动物免疫分离脾细胞制备骨髓瘤细胞细胞融合（PEG法）HAT培养基筛选杂交瘤细胞阳性孔克隆化、扩大培养 再次克隆化克隆扩大培养扩大

5、培养收集上清接种小鼠收集腹水单克隆抗体纯化、保存、杂交瘤细胞冻存四、单克隆抗体制备过程单克隆抗体的应用1.治疗（抗体的人源化、靶向作用） 单克隆抗体的应用2. 诊断 常用双抗体夹心法：感染性疾病、病原体的分型及鉴定、肿瘤标记物等 。单克隆抗体的应用3.研究试剂 最早用于亲和层析纯化抗原。目前已成为人类基因组学、蛋白组学研究的重要工具。单克隆抗体亲和层析蛋白举例 （赛百注射用纤溶酶）单克隆抗体鉴定新蛋白举例五、实验报告研究生抗体技术实验报告学号姓名专业、班实验地点指导教师时间实验项目名称：一、实验目的四、分析与讨论教师评语三、实验结果二、实验内容与步骤成绩：签名：日期： 日 期课次 教学内容 时

6、数及方法授课教员备注理论实验 10.30 （周一晚上） 1实验一：单克隆抗体制备实验设计实验二：细胞培养实验室常用仪器设备 4董文其李珍 11.2 （周四晚上） 2实验三：实验器材的清洗、包装和消毒实验四：细胞培养常用液 4陈白虹 11.6 （周一晚上） 3实验五：小鼠免疫实验六：细胞融合 4董文其李珍 11.9（周四晚上） 4实验七：阳性杂交瘤细胞的筛选 4董文其李珍 11.14 （周二晚上） 5实验八：杂交瘤细胞的扩增、克隆化 4董文其李珍 11.16（周四晚上） 6实验九：细胞的冻存与复苏实验十：单克隆抗体的鉴定 4陈白虹张艳玲 11.20 （周一晚上） 7实验十一：单克隆抗体的制备 4陈白虹 11.23（周四晚上