真核基因表达与调控课件

1、第五章 真核基因表达调控一、顺式作用元件(cis-acting element)BADNA编码序列转录起始点概念: 真核生物中能够被基因调控蛋白特异性识别和结合，并对自身基因转录起始有调节作用的DNA序列。第二节 真核基因表达调控的分子机制真核生物的顺式作用元件包括三类： 类顺式作用元件类启动子RNA pol 类顺式作用元件类启动子RNA pol 类顺式作用元件 类启动子RNA pol 类顺式作用元件调控的基因主要是编码蛋白质的基因，少数是snRNA基因。类顺式作用元件包括： 启动子(promoter)，上游启动子序列(UPS or UPE)，增强子(enhancer)，沉默子（silence

2、r ），及各种反应元件等。1. 启动子类启动子常由TATA盒和部分上游启动子元件组成；是TF D识别部位。TATA盒是其中最主要的结构，位于转录起始点上游-25bp处；一般是含TATA序列的6-7 bp的核心序列： TATA(A/T)(A/T)，在不同基因中有差异但某些类基因无TATA盒，如管家基因等；功能：确保转录精确而有效地从转录起始序列开始2. 上游启动子元件概念：是一些位于TATA盒上游的可调节基因转录DNA序列。主要包括： 1）CAAT盒 以GGNTAATCT为序列特征，能与CAAT结合转录因子（CTF）和CAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）结合 2）GC盒 以CCGCCAAT为序

3、列特征，能与反式作用因子Sp1结合。特点：一般位于启始位点-40-110bp之间，有方向性并与距离有关。作用机制：调节TATA因子与TATA的结合、 RNA pol 与启动子的结合、转录起始复合物的形成等。4. 反应元件概念：能抑制启动子活性的DNA序列。特点：与增强子相似；沉默子与增强子的角色可因调控基因而转换。5. 沉默子概念：某些反式作用因子与特定刺激信号结合后，能与某些上游启动子元件和增强子所结合，调节基因表达，这类顺式作用元件即特称中。种类：激素反应元件、金属离子反应元件、TPA反应元件、血清反应元件等。还有个别蛋白质因子可特异识别、结合自身基因的调节序列，调节自身基因的表达，称顺式

4、作用。由某一基因表达产生的蛋白质因子，通过与另一基因的特异的顺式作用元件相互作用，调节其表达。这种调节作用称为反式作用。 二、反式作用因子(trans-acting factor) （一） 反式作用因子的主要特点一般具有三个结构域：DNA识别结构域、转录活性域和蛋白质-蛋白相互作用结构域；能识别并结合调控区的顺式作用元件；对基因表达有正性调节（激活）和负性调节（抑制）二种方式。其调节机制涉及顺式作用元件、RNA聚合酶和其它调节蛋白。（二）转录调节因子分类 （按功能特性）* 基本转录因子是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，决定三种RNA(mRNA、tRNA及rRNA)转录的类别。TF

5、I；TF II；TF IIITF（转录因子）参与RNA-pol 转录转录因子功 能TF A稳定TF D结合TF B促进pol 结合TF D辨认TATA盒TF EATPaseTF F解旋酶（三）反式作用因子结构特点三个结构域蛋白质-蛋白质结合域（二聚化结构域）转录激活域 谷氨酰胺富含域酸性激活域脯氨酸富含域DNA结合域碱性-螺旋锌指(zinc finger)碱性亮氨酸拉链碱性螺旋-环-螺旋常见的DNA结合域(DNA-binging domain) 1. 锌指结构(zinc finger motif)常结合GC盒含1个螺旋，2个反向平行的折迭；与Zn2+结合C CysH His 在亮氨酸拉链近N-

6、端有富含碱性(带正电荷)氨基酸残基的区域，是DNA的结合区。 亮氨酸拉链是一个高亮氨酸组成的螺旋，每两个螺圈出现一个亮氨酸，形成拉链的一边。 两个蛋白质因子的螺旋通过亮氨酸的疏水作用结合在一起形成拉链结构 (二聚体化)2. 亮氨酸拉链（Leu zipper）亮氨酸拉链3. 碱性螺旋-环-螺旋 4. 碱性-螺旋常结合CAAT盒由碱性氨基酸残基组成。反式作用因子与顺式作用元件之间的特异识别及结合，通常是非共价结合，被识别的DNA结合位点通常呈对称、或不完全对称结构。绝大多数调节蛋白质结合DNA前，需通过蛋白质-蛋白质相互作用，形成二聚体(dimer)或多聚体(polymer)，最常见的是二异聚体化

7、。（四）DNA - 蛋白质 蛋白质-蛋白质的相互作用第三节 真核基因表达的调控基因表达的多级调控基因数目基因激活转录起始 转录后加工mRNA降解蛋白质降解等蛋白质翻译翻译后加工修饰3. DNA拓扑结构变化天然双链DNA均以负性超螺旋构象存在；基因活化后RNA-pol正超螺旋负超螺旋转录方向活化基因侧冀区常有DNaseI超敏位点，对核酸酶敏感，位于调节蛋白结合位点附近。（一） RNA pol I 转录体系的调节RNA pol I 转录产物: 45S rRNArDNA基因的启动子核心元件（核心启动子）上游调控元件(UCE)：增强转录所需转录因子上游结合因子1：结合二个元件选择性因子1：后结合二个元

8、件二、转录起始调控（二） RNA pol III 转录体系的调节转录产物: tRNA和5S rRNA启动子特点：基因的启动子位于转录区tRNA基因所需转录因子：TF IIIC和TF IIIBtRNA基因启动子：A盒和B盒5SRNA基因所需转录因子：TF IIIC和TF IIIB 还需TF IIIARNA聚合酶III的转录起始A box (+10+20)A box (+10+20)TF III CTF III CTF III BTF III CTF III BRNA pol IIITF III CTF III BRNA pol III调节基因表达水平决定基因表达的基础水平与RNA pol II

9、结合，决定转录起始点的精确定位+1结构基因决定基因表达的时空特异性。激素，金属离子等反应元件。其他反应元件使转录增强或减弱增强子或 沉默子维持基本的表达水平（三） RNA pol II 转录体系的调节CAAT盒 GC盒 上游启动子-110-40TATA 盒启动子-25TFDTF A TFBRNA poly/TFFTFEPICDTATABFEDNA起始前复合物（Pre-Initiation Complex，PIC）ARNA polyTATA起始前复合物（PIC）的生成真核生物的转录起始:模板理论(piecing theory) 一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间不同方案组合

10、，生成有活性、专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。 按不同组合，人类约.万个基因，估计需转录因子余个即可。（四）转录起始调控模式表达式调节: 需要时才合成, 随即被降解;共价修饰: 作用时间较长，常见有磷酸化/去磷酸化、糖基化，都作用于Ser和Thr，有竞争排斥；配体结合：如激素受体类反式作用因子，只有当与激素结合才有活性；蛋白质-蛋白质相互作用：如碱性亮氨酸拉链的二异聚体化主要通过调节反式作用因子的活性控制转录起始；反式作用因子（有活性） 反式作用因子（无活性）1. 反式作用因子的活性调节2. 反式作用因子与顺式作用元件的结合多数：先激活后结合;少数：先结合

11、后激活。3. 反式作用因子的作用模式增强子与调基因可以很远，上游启动子亦相隔数十个碱基，如何起作用？作用模式：扭曲、滑动、成环等PEEP扭曲成环EP滑动4. 中介因子对转录起始的调控某些反式作用因子是间接通过中介因子起作用PTFBCREB(cAMP反应元件结合蛋白)CBPP5. 多重增强子作用金属硫蛋白基因：有4个金属反应元件，2个基础水平增强子（与激活蛋白AP1反应），1个糖皮质激素反应元件，这些增强子不同组合产生不同效应；组合式基因调控：有限的反式作用因子，可以通过不同组合调控不同基因表达。DABB基因关闭CBA基因表达A三、转录后调控5帽子结构的作用：防止mRNA被5 3核酸酶降解；能被

12、帽结合蛋白识别，增强mRNA的可翻译性，没帽子结构，翻译效率降低；促进mRNA从核到胞浆的运输过程；增强mRNA的剪接效率, 帽对exon1的剪接尤为重要，需要2个帽结合蛋白参与（CBP80和CBP20）（一）mRNA加帽和加尾的调控意义Poly(A)尾的作用延长mRNA的半衰期限：实际上是一个核酸水解酶降解与Poly(A)聚合酶不断添加A的一种平衡，总趋势是胞浆内Poly(A)逐渐缩短。促进翻译效率： Poly(A)与Poly(A)结合蛋白（PABP）结合；人为除去二者或其一，均降低翻译效率；机制不详；有些mRNA可通过除去Poly(A)降低翻译水平。（二） mRNA选择剪接的调控作用1.

13、mRNA的剪接真核生物中约5%的pre-mRNA可以有二种或以上的剪接方式，形成多种成熟mRNA，翻译成不同的蛋白质。选择剪接方式：外显子选择：也称外显跳跃，选择不同的外显子进行剪接，成熟mRNA中外显子数目不同；内含子选择：在不同的成熟mRNA中，内含子可全无或保留某一个；相斥外显子：二个外显在不同成熟mRNA中只能出现其一，而不能共存；内部剪接点：剪接点异常，导致成熟mRNA出现的只是某个外显子或内含子的一部分。2. 剪接对基因表达的调控凋亡蛋白Bax基因的选择剪接：同一基因产生、等蛋白质；型mRNA中保留全部6个exon，编码192个aa；（正常剪接）型mRNA中保留6个exon及int

14、ron5；编码218个aa；（内含子选择）型mRNA中只保留5个exon，少了exon2，仅编码151个aa。选择剪接产生IB:IB通过选择剪接，产生C端截短了的二种异构体IB 1和 IB 2（ mRNA缺失178个codes），缺少PKA磷酸化位点；形成的NF-B/IB 1和 NF-B/ IB 2，不能解离出活性的NF-B。正常的NF-B PKANF-B/ IB NF-B（有活性） +IB -P（三）RNA编辑的调控作用RNA编辑(RNA editing) 是指转录后成熟的RNA分子的修饰和加工，使得RNA所携带的遗传信息发生改变的过程。RNA编辑有核苷的插入或删除（n个核苷酸）编辑和碱基替

15、换编辑（CU常见）两种类型。在真核生物的tRNA、rRNA和mRNA中都有RNA编辑。RNA编辑有多种机制，不同生物的编辑需要不同的RNA编辑酶。影响基因的表达，生成不同的氨基酸或新的ORF。编辑可在多种水平被调节，且与人类疾病（肿瘤、AS等）有一定的相关性。 RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。5. mRNA的编辑(mRNA editing) 人类apo B基因 mRNA（14500个核苷酸）肝脏apo B100（分子量为500 000）肠道细胞apo B48（分子量为240 00

16、0）mRNA编辑mRNAs的半衰期，如-珠蛋白在10h以上，生长因子、原癌基因等可能仅30min或更短；真核mRNA稳定性常由特异的去稳定元件控制；常见于3-端非翻译区（ 3-UTR）一为特殊的茎-环结构另为约50nt的AU-丰富序列(AU-rich sequence，ARE),一致性序列为(AUUUA)5。这种序列引入可致mRNA的快速降解，去除则不一定会增加mRNA的稳定性。（四）mRNA稳定性调控转铁蛋白3-UTR长达2.6kb，含10个茎-环结构，其中5个为铁反应蛋白元件（IRE）；如去除这些IRE，则mRNA稳定性降低；当IRE与铁反应蛋白结合，可抑制邻近的特异的去稳定序列；当细胞内

17、Fe2+浓度升高， 并与铁反应蛋白结合并使之与IRE解离，转铁蛋白mRNA首先在距3-末端约1000nt处被酶切，随后迅速被降解。生长因子mRNA的3-UTR多有导致不稳定的AU-丰富序列；若通过体外重组将此序列引入很稳定的-珠蛋白mRNA 3-UTR ，则其半衰期会从十几个小时降至几十分钟；组蛋白mRNA 的3-UTR有特殊的茎-环结构，其稳定性受DNA合成的调节； 非DNA合成期，多余的组蛋白与这种茎-环结构结合，导致mRNA降解，半衰退期仅十余分钟；DNA合成期，组蛋白与染色体DNA结合，而不与茎环结构结合，mRNA稳定，半衰退期约1小时。四、翻译的可调控性及调控方式翻译起始复合物80S

18、Met-tRNAimRNA形成之前的各个环节均可进行调节；如mRNA的5非翻译区（ 5 UTR），各种起始因子（eIF2、eIF-4E），起始AUG的位置和数量等均可进行调节。1. 5AUG对翻译的调控：90%以上的真核mRNA翻译始于最近5端的第一个AUG；但有的mRNA 的5UTR有多个AUG（称5AUG ），会干扰正常的ORF。某些癌基因存在这类调节!翻译起始的调节2. 5 UTR长度的影响:太短会导致40S小亚基不易识别起始AUG;5 UTR少于12nt时, 50%以上在40S小亚基起始时会滑起始AUG;AUG前5 UTR以1780nt最适宜,翻译效率与长度呈正相关.3. 阻遏蛋白通过

19、5 UTR调控翻译: （以铁蛋白为例）5AUGUAA5AUGUAA翻译铁结合调节蛋白无翻译五、翻译后加工的调控意义主要因素：肽链中蛋白酶识别位点，决定肽链的降解速度；另一个因素：N-末端氨基酸性质稳定化氨基酸Met, Ser,Thr, Ala, Val, Cys, Gly和Pro，共8种；胞浆中蛋白都如此类；去稳定化氨基酸其余12种；N-末端氨基酸是肽链合成后加入的。（一）新生肽链的水解和N-末端修饰 去除新和肽链N末端蛋氨酸残基并加入一个决定肽链稳定性的氨基酸Met新和肽链氨基肽酶氨基酰-tRNA蛋白转移酶aa决定多肽链的稳定性（二）通过信号序列分栋、靶向运输和定位信号序列(signal sequence)所有靶向输送的蛋白质结构中存在分栋信号，主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称为信号序列 。1. 分泌蛋白的信号肽真核细胞分泌蛋白等前体合成后