蚕豆病 生化设计实验课件

1、2011级临床四大班第四实验室1,2小组组员：杨从德（201101171） 王永波（201101168） 武桂芬（201101170） 王小花（201101167）试验时间:第十八周生化设计实验()一、根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？蚕豆病恶心、呕吐、面色苍白 皮肤及巩膜黄染 红细胞 1.981012/L 血红蛋白53g/L 血清总胆红素85.5mol/L 尿蛋白（+） 尿胆红素() 尿胆素原(+) 尿液镜下未见红细胞 黄疸红细胞膜不完整，已破裂红细胞含量少含量明显增加血红蛋白量减少排尿呈酱油样色游离胆红素增加溶血性黄疸蚕豆病肠肝循环增多蚕豆病简介蚕豆病是一种6-磷

2、酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。 易发人群多见于儿童，男性患者约占90%以上。 二、设计实验高铁血红蛋白还原试验 G6PD荧光斑点试验 红细胞G6PD活性测定筛选试验确诊试验实验原理一、高铁血红蛋白还原试验实验原理：在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反

3、应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术）亚铁血红蛋白 高铁血红蛋白高铁血红蛋白还原酶 NADPH(辅酶) 亚甲蓝(递氢体)实验反应方向实验流程取静脉血1. 8mL 于抗凝管，混匀抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝剂+葡萄糖20 mg)离心沉淀 1000 r/ min 15 min调整 血细胞血浆=11 ，混匀 调整后全血（备用）1ml 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 混匀 混合试剂（备用） 1ml 0.14 mmol/ L 亚甲基蓝液高铁血红单白还原实验实验流程取试管3 支,标上A、B、S ,按下表加入试剂

4、高铁血红蛋白还原试验操作步骤混合试剂/ mL 0. 01 / /生理盐水/ mL / 0. 01 /0. 18 mol/ L 亚硝酸钠- / / 0. 010. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 经调整的全血/ mL 0. 1 0. 1 0. 1来回摇动1520 次,置37 水浴箱静置3 h蒸馏水 10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml 试剂 A B S高铁血红单白还原实验B管为空白管, 在波长635 nm处，测定“A”管及“S”管吸光度实验流程计算高铁血红蛋白还原率公式：MHb % = (1 - A/ S) 100 % 高铁血红单白还原实验试剂：反应液：G-6-P液1份、N

5、ADP液1份、皂素2份、磷酸盐缓冲液3份和蒸馏水3份混匀仪器：长波紫外灯、滤纸、水浴箱G6PD荧光斑点试验 实验流程G6PD荧光斑点试验 取试管，加10l全血+100l反应液，混匀，取一滴于滤纸上（第一斑点 ）作为对照将上液置于37水浴10min ，再取一小滴滴于滤纸上（第二斑点）实验组 晾干后，于长波紫外灯下（365nm）观察结果，计时 根据结果作出相应诊断试剂：生理盐水、溶血素 、3.8mmol/L NADP 、0.5mol/L Tris缓冲液（pH7.5） 、0.63mol/L氯化镁溶液 、33mmol/L G-6-P液 仪器：紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管 实验流程取抗凝血2ml，

6、生理盐水洗涤红细胞3次（1500r/min离心 10min）除去上清液和乳白层（白细胞和血小板）加等体积生理盐水红细胞悬液红细胞悬液0.05ml+溶血素0.5ml，混合，放置10min 溶血液并测定其Hb浓度进行比色 （见下表）红细胞G6PD活性测定 G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法 )试管 对照管 测定管 NADP液（ml） 0.1 0.1Tris液（ml） 0.1 0.1氯化镁液（ml） 0.1 0.1蒸馏水（ml） 0.68 0.58G6P液（ml） 0.1 37预热溶血液（l） 20 20红细胞G6PD活性测定立即340nm处测吸光度，以对照管调零，37恒温，每分钟观察1

7、次，记录吸光度的变化实验流程计算公式：G-6-PD活性（U/gHb） =A/min1000/6.221020/20 Hb(gL-1) A/min:每min吸光度的平均变化值1000/6.22:为微摩尔消光系数1020/20:总容量与溶血液的量之比； 实验流程红细胞G6PD活性测定结果分析方法一、高铁血红蛋白还原试验： 正常值：MHb还原率=75%，脐血=77% 临床诊断：纯合子和半合子（XY）患者： MHb还原率 30% 脐血 40% 杂合子患者： MHb还原率 31%74% 脐血 41%76%二、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验 正常人： 0min斑点无荧光，5-10min出现， 10mi

8、n荧光最强 临床诊断： 轻度缺陷者：0-10min荧光很弱或不出现 中度缺陷者：10-30min出现荧光 严重缺陷者：30min内不出现荧光结果分析方法三、从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果细胞膜的破坏胆红素的异常还原型谷胱甘肽 体内重要的抗氧化剂 保护红细胞膜蛋白的完整性 红细胞膜的破坏单核吞噬细胞识别吞噬血红蛋白珠蛋白氧化破坏红细胞氧化破坏红细胞单核吞噬细胞识别吞噬氧化破坏红细胞血红蛋白单核吞噬细胞识别吞噬氧化破坏红细胞珠蛋白血红蛋白单核吞噬细胞识别吞噬氧化破坏红细胞血红素珠蛋白血红蛋白单核吞噬细胞识别吞噬氧化破坏红细胞 单核吞噬细胞识别吞噬血红蛋白珠蛋白氧化破坏红细胞氧化破坏红

9、细胞单核吞噬细胞识别吞噬红细胞血红蛋白单核吞噬细胞识别吞噬红细胞珠蛋白血红蛋白单核吞噬细胞识别吞噬红细胞血红素珠蛋白血红蛋白单核吞噬细胞识别吞噬红细胞胆红素代谢异常血红素运送到肝与血清蛋白结合游离胆红素结合胆红素排出体外 进入肠道胆素原胆素肠肝循环胆红素扩散进入组织 组织黄染 黄疸排尿呈酱油样色溶血性贫血 面色苍白四、要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？（选答）基因结构分析法我组讨论认为：要想探讨该病发生的分子基础 ，需要对目的基因进行基因结构分析，即DNA序列检测DNA序列测定方法直接法间接法：对于未知片段，或片段过长，用几种方法（RFLP；PCR-RFLP；SSCP

10、）来粗略的估计待分析基因的一级结构是否与对照基因相同双脱氧末端终止法（Sanger法）化学裂解法（Maxam-Gilbert法）DNA的自动化测序DNA序列测定方法DNA链的方向是5 3交替的磷酸基团和戊糖构成了DNA的骨架 (backbone)。五、患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？（选答） 患者体型瘦小与该病症有关 蚕豆病是因为体内缺乏G6PD， G6PD主要影响体内的磷酸戊糖途径 该途径主要生成两种重要的物质即5-磷酸核糖和NADPH5-磷酸核糖影响：1：核酸的合成 2：体内己糖和戊糖的代谢 3：37碳原子糖类物质的相互转化NADPH影响：1：体内以NADPH作为供氢体合成多种活性物质如胆固醇 脂肪酸 和一些非必需氨基酸2： NADPH可作为羟化酶的辅酶，参与体内生物转化