革兰氏阴性微需氧和厌氧菌的检验

1、革兰氏阴性微需氧和厌氧菌的检验本类共包括8个属和1个科：1、弯曲菌属，2、水螺菌属，3、螺菌属，4、固氮螺菌属，5、海洋螺菌属，6、蛭弧菌属，7、吸血弧菌属，8、螺杆菌属，以及拟杆菌科。在医学检疫上有意义的是弯曲杆菌和螺杆菌属。一、 弯曲菌属 Campylobacter 一类呈逗点状或S形的革兰氏阴性杆菌，广泛分布于动物界，其中有些可引起动物和人类腹泻、胃肠炎和肠道外感染。目前弯曲菌属有18个种（含亚种），对人类致病的主要是空肠弯曲菌和胎儿弯曲菌的胎儿亚种，前者引起人类急性腹泻，后者在免疫功能低下时可引起败血症、脑膜炎等，其次是胎儿弯曲菌和大肠弯曲菌等。 1983年分离的幽门弯曲菌则与慢性胃炎

2、和胃溃疡、十二指肠溃疡有关。兽医临床上常见的有五个种（含亚种）：空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌（胎儿亚种和性病亚种）、小肠弯曲菌、幽门弯曲菌。其中以空肠弯菌最多见，胎儿亚种次之。致病性（一）形态与染色1、0.2-0.41.5-3.0m； G-, 呈弧形、S形或海鸥展翅状，不易着色；2、无芽孢，一端或两端各有一根鞭毛，运动活泼，形态似霍乱弧菌；3、从微需氧到厌氧，CO2有利于其生长。（二） 培养特性微需氧，最适生长环境: 氧气5、二氧化碳10、氮气85；通常42初分离空肠弯和大肠弯曲菌，其他菌株37生长良好。营养要求高，普通培养基不生长，常用含头孢哌酮的选择性培养基，以抑制肠道正常菌群。含血的Skirr

3、ow培养基、头孢哌酮-万古霉素-两性霉素琼脂培养基（CVA）和不含血的碳-头孢哌酮-去氧胆酸盐（CCDA）、碳基选择性培养基（CSM）和半固体动力培养基等常用于分离该属的细菌。在凝固血清和血琼脂培养基上培养36小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落呈中心凸起，周边不规则，无溶血现象。（四） 抵抗力抵抗力较弱，易被干燥、直射日光及弱消毒剂所杀灭，56、5min可被杀死。但耐寒，在4冰箱或水中可存活4周。对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感。但近年发现了不少耐药菌株。 （五）抗原构造本菌抗原构造比较复杂，与肠道杆菌一样具有O、H和K抗原。根据O抗原，可把空肠弯曲菌分

4、成45个以上血清型。 目前分型没有被广泛应用。（六）毒力本菌具有粘附定居和入侵上皮细胞的能力，通过产生的肠毒素、细胞毒素和内毒素等多种毒力因子致病，病变部位通常在空肠和回肠，也可蔓延至结肠。（七）致病性 可引起人畜急性传染病弯曲菌病。 1、带菌者：动物和人类，经肠道或生殖道排出； 2、感染：经口(污染的食物或水)；经产道感染婴儿； 3、临床症状：潜伏期1-10d，一般3-5d。 （1）肠炎：腹泻、腹痛、呕吐及发热等，初为水样，继而转为粘液便，少数呈脓血便。 （2）肠道外感染：可致菌血症、心内膜炎、脑脊髓膜炎、血栓性静脉炎、关节炎、肺脓肿和腹膜炎等。 （3）母畜感染：上呼吸道症状、肺炎、发热及菌

5、血症；死胎或流产；新生畜败血症及脑脊髓膜炎。（八）微生物学诊断1 粪便直接镜检，G-呈弧形、呈投镖式运动。2 核酸检测粪便 细菌鉴定（九） 检验程序1. 标本采集 采集粪便及剩余食物，立即送检，或将标本接种于卡-布运送培养基中送检；对于高烧和脑膜炎者，于用药前抽取静脉血或脑脊液，注入布氏肉汤送检。2. 细菌检验（1）显微镜检查 悬滴法动力检查：显微镜下观察有无螺旋状或投标样运动，脑脊液标本经离心沉淀后再制成悬滴标本检查； 染色标本检查：取新鲜粪便或脑脊液离心沉淀物涂片、革兰氏染色，找革兰氏阴性、弯曲呈S状或螺旋状杆菌，鞭毛染色见一端或两端单根鞭毛；（2）分离培养 将标本直接接种于选择性培养基上

6、，也可将标本过滤后培养，弯曲菌形成的菌落为灰色、扁平、表面湿润、圆形凸起、边缘不规则，常沿穿刺线蔓延生长，血平板不溶血，布氏肉汤中呈均匀混浊。3. 细菌鉴定弯曲菌属的鉴定较复杂，必须综合多种试验确定。通常氧化酶阳性、革兰染色阴性、弯曲呈S形或螺旋形，进一步鉴定试验：马尿酸盐水解试验：鉴别空肠弯曲菌空肠亚种和多氏亚种的重要试验；前者阳性，后者阴性。醋酸吲哚水解试验：空肠弯曲菌为阳性而胎儿弯曲菌为阴性。萘啶酸、头孢噻吩耐药试验： 空肠弯曲菌和大肠弯曲菌对萘啶酸敏感，对头孢噻吩耐药； 胎儿弯曲菌对萘啶酸耐药而对头孢噻吩敏感。近来出现了对萘啶酸耐药的空肠弯曲菌，应结合醋酸吲哚水解试验进行鉴定。空肠弯曲

7、菌检验国标法：GB/T4789.9-2008弯曲菌属的鉴定空肠弯曲菌的鉴定二、 螺杆菌属 Helicobacter 螺杆菌属（Hilicobacter）是一群氧化酶和触酶阳性、微需氧、37生长、25和42均生长不良的革兰阴性弯曲菌。幽门螺杆菌（一）形态与染色革兰氏阴性、无芽孢、呈螺旋状弯曲，杆状，尤其在胃粘膜环境中，幽门螺杆菌具典型螺旋形或弯曲形，但在陈旧培养物中菌体可呈圆球状；多数细菌具有位于菌体一端的多根带鞘鞭毛，运动活泼。 （二） 培养特性微需氧，有氧及无氧环境均不生长，潮湿，37，5-10O2、5-12CO2生长良好，5-10H2可刺激其生长；最适温度35-37，30和42均生长不良，

8、此点可与其他弯曲菌区别，生长pH5.5-8.5。普通培养基不生长，需补充血、血清、淀粉、活性炭等。常用心脑浸出液琼脂、布氏琼脂、哥伦比亚琼脂等。选择性培养基：改良的Skirrow琼脂培养基加入万古霉素、两性霉素和头孢磺啶。血平板：经3-5d形成小的半透明灰色菌落，有微弱的溶血环，革兰氏染色浅。 （三） 生化反应生化反应不活泼，氧化酶和触酶阳性，不分解任何糖类，脲酶强阳性，可与本属其他细菌区别，也是检测HP的快速诊断方法之一。（四） 抵抗力对酸敏感，尿素可保护该菌，1胆盐可抑制其生长。 耐药性：对多粘菌素、三甲氧苄氨嘧啶、磺胺、万古霉素和萘啶酸天然耐药。在体外药敏试验中，该菌对不少抗生素敏感，但

9、体内用药效果不佳，主要因为该菌寄生在粘液层下的胃上皮细胞表面，抗生素不能渗入胃粘膜深层。临床上治疗该菌的药物有阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素、四环素、呋喃唑酮等。 （五） 致病因子与致病性该菌有较强的鞭毛动力，对胃粘膜有较强粘附力，在接近中性的粘膜层定植，产生强活性尿素酶以分解尿素，在菌体周围形成保护性氨环境，以抵抗胃粘膜上皮细胞分泌的胃酸；该菌产生的蛋白酶能有效分解粘液蛋白，提供营养。幽门螺杆菌在胃内定植后，粘附于胃粘膜上皮细胞、通过胃肠激素刺激和细胞壁脂多糖中脂质A的致炎作用、产生多种酶(尿素酶、蛋白酶、过氧化氢酶、脂酶和磷脂酶等)以及细胞毒素，共同作用导致临床疾病的发生。主要引起消化性溃疡（

10、十二指肠溃疡、胃溃疡）、慢性活动性胃窦炎等，长期感染易发展为萎缩性胃炎、胃腺癌和胃粘膜淋巴组织淋巴瘤。（六）微生物检验（七） 微生物学诊断 1、 标本采集 采集胃和十二指肠粘膜新鲜标本，置2ml无菌生理盐水，运输途中不超过3h，4不超过5h。流行病学调查时可取血清。2、显微镜检查直接镜检：取胃、十二指肠粘膜活检标本作革兰染色，在油镜下查找细长弯曲或呈海鸥展翅状排列的菌体；组织学切片：可行Warthin-Starry银染、改良Giemsa染色、甲苯胺蓝染色、石炭酸复红染色等。3、分离培养5绵羊血的布氏琼脂或7马血的心脑浸液分离，用改良的Skirrow琼脂（万古霉素和两性霉素各10mg/L、甲氧苄啶5mg/L）选择性培养，在含5O2、10CO2、85N2的微需氧环境37孵育3-5天，长出细小、灰白色、半透明、不溶血的菌落。 4、快速检查快速脲酶试验：取一小块新鲜活检标本置于含尿素的培养基，由于幽门螺杆菌产生大量的细胞外尿素酶，可分解尿素产大量氨，培养基pH升高，指示剂变色，可在5-30min内检测出幽门螺杆菌；该法简便实用、快速灵敏且较