国内溶菌酶应用发展陈邱

1、国的溶菌酶的应用与发展溶菌酶,又称胞壁质酶。球蛋白G、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。最早对溶菌酶的研究起于Nicolle1907年公布的枯草芽孢杆菌中的溶解子,1922年Fleming等发现,在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶,所以被命名为溶菌酶1。1965年,英国的菲利普等用X衍射法对溶菌酶进行研究解析,第一个完好弄清了溶菌酶的立体构造2。今后辈们发现溶菌酶广泛地存在于高等动物组织及分泌物，植物及各种微生物中,其中在新鲜的鸡蛋清中含量最高。溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其他组织,且自己无毒无害,所以它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂,防腐剂,将可应用于食品防腐、医药

2、制剂日用化工等行业。在我国,溶菌酶的应用围和应用量还比较有限,但能够预计，溶菌将会是应用于我国食品工业中一种重要的功能性食品增加剂。溶菌酶的构造特点和抗菌作用体系构造特点与复杂性大多数鸡蛋清溶菌酶是由129个氨基酸组成的碱性球状蛋白,相对分子量在1400018000。其等电点可达107,存在4个二硫键。正常条件下溶菌酶作用的最适温度为4550。蛋清溶菌酶在低温干燥下可长远保存。其纯品为白色粉末状结晶,无臭、味甜,易溶于低浓度的食盐水。在碱性条件下易被破坏,但在酸性溶液中其化学性质牢固,热牢固性很强,在pH47时,100下办理1min酶仍保持优异的活性,在pH3时,100加热办理45min还可以

3、保持活性3。溶菌酶在水溶液中6215下,保持30min则完好失活,在2015%的乙醇中,在6215下保持20min而不失活4。王玮等5研究表示。在一元醇和二元醇溶液中溶菌酶分子的牢固性均随着醇浓度的增大而提高。人溶菌酶分子量为14600,由130个氨基酸组成,也存在4个二硫键,其酶活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍左右。在生产或应用溶菌酶时,由于工艺或环境的变化,极易造成酶的变性失活,所以必定采用一定的手段使蛋白复性，减少损失。史晋辉等7研究发现,当酶浓度较低时,017mol/L的盐酸胍即可使溶菌酶完好复性。其他,溶菌酶和其它酶拥有相似的性质,Karuppiah等8研究表示,向复性溶液中加入适合的-环糊

4、精,可使变性的碳酸脱水酶的复性率达到80%。董晓燕等9利用-环糊精和十六烷基三甲基溴化的结合作用,在适合盐酸胍浓度下,溶菌酶可完好复性。王彦等利用离子交换色谱法研究发现,当复性缓冲液中不含其他盐类时,脲浓度为210mol/L时复性产率最高,当脲浓度高时,硫酸铵能很好地提高溶菌酶的复性回收率。溶菌酶的抗菌作用体系当前已知的几种溶菌酶有:-N-乙酰己糖胺酶、酰胺酶-1,3、-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、几丁质酶、磷酸甘露糖酶脱、乙酰壳多糖酶11。参加细菌细胞壁溶解作用的溶菌酶大体可分为作用于糖苷键和作用于肽和酰胺部分的两类。-N-乙酰己糖胺酶、-1,3、1,6葡聚糖酶等主要作用于糖苷键,使糖苷键断

5、裂,破坏细胞壁的分子构造,而酰胺酶等则主要作用于多肽,使多肽断裂。以-N-乙酰己糖胺酶为例,-N-乙酰己糖胺酶能够催化水解细胞壁肽聚糖分子中的N-乙酰胞壁酸(NAM)与N-乙酰葡萄糖氨(NAG)之间的-1,4糖苷键,使肽聚糖分子发生断裂,使细胞壁外两侧浸透压失衡,造成细胞破裂,以致微生物因细胞壁溶解而被杀死12氏阳性菌由于两者细胞壁中肽聚糖含量不同样而存在差别,G+细胞壁含80%肽聚糖,而G-细胞壁只有在壁层含有少量肽聚糖。结晶法是传统的提取溶菌酶的方法,此方法原料易得,制备过程不是很烦杂。开初MayerAbraham等研究并利用此法,于1937年获取结晶状物质13,1945年Alderton

6、等提出直接结晶法制备溶菌酶的方法14。景芝等15对传统结晶法做出了改进,经过调整透析液pH值,加入磷酸盐,再调整其pH值,尔后离心去除杂质获取纯化液,使产率提高,活性增加。离子交换层析法离子交换层析法是依照各种蛋白质所带电荷数的不同样而与离子交换剂之间结合力的差别,进而将不同样蛋白质分其他技术。该法应用于溶菌酶分别始于80年代,由于其操作简略、高效、成本低、可自动化连续操作的优点,素来以来都是溶菌酶生产的常用方法16。当前外国常用的离子交换剂有Duolite-464、724、732弱酸性阳离子交换树脂、D903、201大孔离子交换树脂、羧甲基纤维素(CMC)和羧甲基琼脂糖等17。宋宏新等18采

7、用724树脂,装柱后抽提液缓慢流入柱中,用缓冲液冲洗，再用硫酸铵洗脱,结果表示724树脂的吸附率达到8315%。由于Duolite-464特别适合于连续自动化操作,所以利用它来分别纯化溶菌酶,可获取较高的产率。如LiChan等19用Duolite-464从性质均一的蛋清溶液中分别溶菌酶,使溶菌酶的回收率达90%。亲和层析法亲和层析法是依照酶与作用底物的特异性亲和能力,利用酶分子独有的专一性结合位点或构造性质的分别方法20。它的应用始于上世纪70年,由于底物能够专一性与溶菌酶结合,进而与其他蛋白分别,是一种高效的分别方法。当前利用亲和层析法分别溶菌酶的报道很多,如HeLZ等21采用多步亲和层析法

8、分别纯化溶菌酶,结果表示,利用三亲和过滤系统从原料中纯化溶菌酶,与一步法对照产率从61%提高到96%。超滤超滤是一种新兴分别纯化技术,利用控制超滤膜孔径大小来滤过杂质,水及小分子物质能够经过,进而获取产物。在反渗析及浓缩等工艺中广泛应用,同时在蛋白质分别中应用也开始流行。与传统生化分别技术对照,它的优点是产品的产出量高、杂质少、纯度相对较高。在2000年,GhoshR等22采用小型的中空纤维超滤系统(30kDaMWCO,聚砜膜)从蛋清干粉中分别溶菌酶,溶菌酶选择性透过膜,而其他大分子蛋白质被膜所截留。溶菌酶的粗提液经过超滤技术后,有时部分杂质如无机离子等未能全部除掉若将超滤与结晶法,或是与离子

9、交换法等结合将获取精制溶菌酶。邹明媚等23报道,超滤浓缩溶菌酶经CM-SepharoseFF阳离子交换柱后,纯度提高2119倍。灏等24研究表示,将磷酸盐缓冲液稀释10倍,在24MPa下均质,利用截留相对分子质量为30000的聚醚砜(PES)膜进行超,溶菌酶制品活力达到14610u/mg溶菌酶活性的测定当前,外国对溶菌酶活性的测定方法,主要有比浊法、紫外分光光度法、比色测定法、琼脂火箭糖电泳法和高效液相色谱法等,但上述各种方法中均存在必然的缺点,如比浊法搅乱因素多,重复性差,对单个样品测定速度快,比色法操作简单但误差较大,所以,各种方法都在不停改进中。传统方法测定溶菌酶活性时要将溶微球菌制成冻

10、干粉,此过程不但步骤烦杂而且易造成细菌大量死亡,影响结果。玉萍等向溶壁微球菌直接加保护剂(20%的甘油)置于一般采用了近似的方法。采用聚苯乙烯微量反应板,建立了微量快速比浊检测溶菌酶的方法,使标本用量减少,反应时间缩短,矫捷度较好。近来几年来,好多报道采用标记乙二醇化几丁冰箱冷冻,使用时解冻,读第1min的吸光度值和第2min的吸光度值即可。使溶菌酶的测定方法更加节约高效,正确性又好。溶菌酶在食品、生物医药等工业中的应用溶菌酶作为一种天然蛋白质,能在胃肠被消化和吸取,对人体无伤害作用,是一种安全系数很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。由于溶菌酶拥有优异的理化特点,拥有必然的保健作用,如在化妆品

11、中用可除掉粉刺,使皮肤滑嫩,促进皮肤的新代谢;有止血,促进组织再生的作用,如在牙膏中增加可防范牙龈出血、保护牙龈并拥有杀菌作用。所以溶菌酶的应用领域特别广泛,在食品、医药、生物工程等方面都拥有很大的应用远景。其他,溶菌酶除作为医药原资料外,仅在食品防腐、增强方面市场就比较可观,如乳制品、肉制品、酒类发酵、水果防腐等方面。随着对溶菌酶的研究的深入和应用产品的不停开发,溶菌酶一旦被人们认识接受,其对市场的占有率将大幅提高。溶菌酶在食品中的应用溶菌酶在乳制品中的应用人乳与牛乳的最大差别之一在于溶菌酶的含量,在欧洲溶菌酶已经广泛用于婴儿食品增加剂,将必然量的溶菌酶增加到牛乳及其制品中,使牛乳人乳化,能

12、够增强血清灭菌蛋白,-球蛋白等防守因子,控制肠道中腐败性细菌的增殖,增强婴儿对病菌的抵抗力。所以,在牛乳或奶粉中增加必然量溶菌酶,不仅防腐,而且增强营养,有利于婴儿健康成长。其他,在奶酪产业溶菌酶也被广泛使用,如在干酪生产中取代硝酸盐,加入01001%的溶菌酶,可防范干酪产气,保持香味物质丁酸。德国于1995年11月22日宣布了奶酪法规,赞同使用溶菌酶来阻拦在半硬奶酪的生产中由厌氧孢子增殖所引起的胀气现象。溶菌酶在肉制品中的应用低温肉制品由于口胃鲜嫩,营养丰富,获取花销者的喜爱。但由于肉类冷藏的温度,其实不能够完好杀死微生物或控制其生长,所以保鲜期短,不能够满足花销者需求。溶菌酶自己无毒、无害

13、,可取代如苯甲酸及其钠盐等化学防腐剂增加到肉制品中,能有效延长食品保质期。采用0105%溶菌酶和0105%Nisin混杂液保鲜猪肉,4下可保鲜12d,真空包装保鲜期可达24d。在此基础上增加了18%NaCl和415%葡萄糖组成复合保鲜剂,用于小包装切割冷却肉的保鲜,保质期明显提高。同样,曾友明等将溶菌酶与Nisin、复合磷酸盐、茶多酚、酪朊酸钠组成复合保鲜剂与鲜肉混杂,制成盐水火腿,其保质期可达3个月。同时,溶菌酶在红肠的加工,延长其货架期方面的报道也特别多。整体上溶菌酶在肉制品上的保鲜作用已经获取认可,而且获取了很多的进展,各种相关工作也在广泛张开。溶菌酶在海产品和水产品保鲜上的应用研究采用

14、0105%的溶菌酶、115%甘氨酸和3%的食盐溶液中将海产品或水产品浸渍5min,沥干水分,常温下保存9d后无异味、无色彩变化溶菌酶的使用,极大提高了海产品或水产品的保鲜期,对其储蓄运输等带来了很大的方便。溶菌酶在低度酒及饮料中的应用在低度酒中增加溶菌酶不但对酒的风味无任何不良影响,还可防范产酸菌生长,是低度酒优异的防腐剂。在日本清酒部分微生物不能够生计,但有一种叫做火落菌的乳酸菌则能生长，并产酸使酒发臭,增加溶菌酶后火落菌被有效控制,成功取代水酸作防腐剂用于清酒中，向葡萄酒中加入必然量的溶菌酶,能够大大减少SO2的使用量,减小了SO2使用过多可能对人体造成的伤害作用。溶菌酶在基因工程和酶工程

15、上的应用随着生物科学的发展,溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不能少的工具酶,用以制造和提取菌体的活性物质如核酸,酶及活性多肽等利用其专一性水解细胞壁的特点,有助于人们对细胞壁细微构造的认识,为我们深入研究细胞壁的构造打下了牢固的基础,同时作为是一种重要的破壁酶,在原生质体的制备方面供应了新的方法,所以溶菌酶被广泛应用于生物技术、生物工程中。溶菌酶在抗菌消炎、增强免疫力方面的应用溶菌酶对G+、枯草杆菌等有很好的杀灭作用,对大肠杆菌、一般变球菌等G-也拥有必然程度溶解。其他,溶菌酶与抗菌素合用收效更佳。所以,溶菌酶广泛应用于医药行业,如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症,特别对急性炎症如急性咽炎、急性喉

16、炎、急性中耳炎等收效明显。溶菌酶在多种疾病诊断方面的应用,正常情况下,人体尿液中一般只存在少量溶菌酶,所以测量尿中溶菌酶含量,有助于检测肾小管功能阻拦性疾病。同时,烧伤病人分泌的溶菌酶比常人多出几倍,也可在尿液中检出,有助于对手术移植排斥、烧伤严重程度的判断。其他,血清中溶菌酶含量高低对白血病的诊断起辅助作用。第一把血清溶菌酶水平的测定作为白血病分型的依照,供应了诊断急性白血病的新方法。我国溶菌酶的生产应用现状及远景随着环境的污染日益严重科学技术的进步和人民生活水平的提高,人们对食品和医药的安全性要求越来越高,好多对某些化学防腐剂已限制使用,所以高效、安全、,拥有天然活性成分的溶菌酶必然倍受人

17、们的关注。当前,外国对溶菌酶进行了较深入的研究,我国对溶菌酶的研究、应用起步较晚,诚然接踵张开了一些相关溶菌酶提取和应用方面的研究工作,但与发达对照溶菌酶制造业规模小、设备和生产技术相对落后。当前,外国主要从蛋清中提取溶菌酶,由于从蛋清中提取溶菌酶,是一项生产相对简单、投资较少、见效快的工程,对于畜产品深加工、综合利用,均有巨大的经济价值。蛋清溶菌酶在外国已于20世纪80年代进入规模化生产,上世纪90年代末以来,已形成近千吨的市场规模,溶菌酶生产厂家主要分布在欧美亚等地。其中丹麦、加拿大占世界市场的一半以上,由于我国生物酶工程研究起步比较晚,我国于20世纪80年代对蛋清溶菌酶技术开始研究,已多

18、次列为“863”计划及“十五计划”等的重点科研攻关项目。当前国已投产的蛋清溶酶,才能达到有效的防腐收效。其次,为了更好的发挥溶菌酶防腐作用,能够与其他物质配比使用。如甘氨酸和溶菌酶的配比使用可获取了很好的防腐收效。近来几年来天然防腐剂越来越碰到食品花销者的喜爱,所以开发高效、安全、性能牢固和经济的天然防腐剂已成为外国一个炙手可热的研究领域,而溶菌酶优异的理化性质恰好吻合人们对食品安全性的要求,它将成为新式食品防腐剂中重要一员发挥越来越重要的作用。菌酶企业有好多家,全国年产量不足50吨,溶菌酶的生产特别是高活性的溶菌酶供应还不能够满足我国日益增加的需求。溶菌酶拥有特异性,只能控制某些细菌而不能够降解真菌的细胞壁,若在今后食品应用溶菌酶时,还应注意几个事项:第一,要充分认识食品的营养成分、pH、食盐浓度等影响溶菌酶收效的因素以